Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Ein. Gründung der Fibroblasten-Kulturen aus Hautexplantaten 4 mm Stanzbiopsien vom menschlichen Unterarm erworben werden in MEM platziert ergänzt 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 pg / ml Fungizone. Schneiden Sie subkutanes Fett und fein hacken die Biopsie in kleine Stücke durch Schaukeln eine Reihe 24 Skalpell gegen den Boden der Petrischale. Die Gewebeschnitte Aufschlämmung in einem 25 cm 2 Gewebekulturbehälter mit primären Fibroblasten Wachstumsmedium (MEM mit 10% FCS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 25 ug / ml Fungizon ergänzt) zugesetzt, bis die Oberfläche des Fadens bedeckt, aber flüssige Tiefe unzureichend für Gewebe zu schweben. Nach 3-tägiger Inkubation bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2, 3 ml von primären Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medien. Nach einer weiteren 3 Tagen Inkubation Change-Medien mit frischen primären Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medien, oder wenn cells sind nahezu konfluenten sie 1.04 kann in frischen Medien aufgeteilt werden. (Fungizone können ab diesem Zeitpunkt entfallen). 2. Stufe I – Herstellung von Kollagen I aus Rattenschwänzen Hinweis: Protokoll für ca. 12-14 Jugendlichen (frisch oder gefroren) Rattenschwänzen Planen Rattenschwanz durch Waschen in 70% igem Ethanol und entfernen Sehnen wie folgt: Entfernen Sie die Haut vor Rattenschwanz durch Schneiden in der Mitte des Schwanzes von oben nach unten mit einem Skalpell und Läuten entlang der Länge des Schwanzes. Trennen Sehne vom Kern des proximalen Bereich des Schwanzes. Entfernen Sehne zu dem distalen Bereich des Schwanzes Vermeidung der Hülle mit gezahnten Pinzette. Extrakt 1 g Sehne / 250 ml 0,5 M Essigsäure durch Rühren bei 4 ° C für 48 h durchgeführt. Zentrifugieren Extrakt (7.500 xg) für 30 Minuten und entsorgen Sie die Pellets. Hinzufügen eines gleichen Volumens von 10% (w / v) NaCl zu dem Überstand, und rühren für 30-60 min. <li> Säule (10.000 × g) für 30 Minuten, den Überstand verwerfen und wieder aufzulösen der Niederschlag in 0,25 M Essigsäure bei ~ 1:1-Verhältnis von Rühren für 24 h bei 4 ° C. Dialysieren das Kollagen Lösung gegen 6-8 Änderungen 6L ~ 17,5 mM Essigsäure (1 ml Essigsäure je Liter kaltes Wasser, Wechsel 2 x täglich). Zentrifuge dialysiert Kollagen bei 30.000 xg für 1,5 Stunden. Überstand entfernen und in sterile Flasche. Einstellen der Kollagen I-Konzentration auf ~ 2 mg / ml unter Verwendung von 0,5 mM Essigsäure bei 4 ° C. 3. Stage II – Einrichten der 3D-Matrix mit eingebetteten Fibroblasten (lassen für 8 Tage kontrahieren). Montieren Sie die Mischung mit kalter Reagenzien bei 4 ° C in einer vorgekühlten Flasche. Halten Kollagen I auf Eis. Für ein T75-Flasche von konfluenten Fibroblasten (~ Zellzahl 1 x 10 6) Verwendung: 25 ml Rattenschwanz Kollagen (ca. conc 2mg/ml) 3 ml 10xMEM 0,22 M NaOH: erste, fügen 2ml, dann tropfenweise unter Rühren, bis das Kollagen wird orange, aber nicht rosa (in der Regel bis zu 3 ml). Ungefähre p H = 7,2. Anmerkung: Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Mittel / Gel-neutral oder schwach sauer bleibt als Fibroblasten nicht zusammenziehen wird, wenn das Gel noch leicht alkalischen Bedingungen ausgesetzt. Trypsinise die Fibroblasten, drehen bei 400 xg für 5 Minuten und entfernen Überstand. Während 5 Minuten vor spinnen: Bereiten 12 x 35 mm Kunststoff-Geschirr – normalerweise erreicht 12 Gerichte aus einem Kolben von Fibroblasten / Kollagen-Mix. Resuspendieren Fibroblasten in 3 ml FCS und sofort an das Kollagen Mischung hinzufügen und umrühren. Platte etwa 2,5 ml Kollagen / Fibroblasten pro Schale so schnell wie möglich. Versuchen Sie, Blasen und Kollagen Einstellung zu vermeiden. Lassen Sie das Kollagen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft für 10 Minuten eingestellt. 1ml von Fibroblasten wachsenth (DMEM + 10% FCS). Trennen der Kollagen / Fibroblasten-Matrix von den Seiten der Schale mit Hilfe einer Pipette. Nächster Tag: In 1 ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (DMEM + 10% FCS). Ändern Medien jeden zweiten Tag. Lassen Kollagen / Fibroblasten Matrix Vertrag für ca. 8 Tage, bis sie in einer 24-Well-Platte passen (Kontraktion von ~ 3,5 cm bis 1,5 cm im Durchmesser, siehe Abbildung 1). Hinweis: Die Kollagen-Konzentration sollte so eingestellt werden, um die Anwendung angepasst werden. Je verdünnter die Kollagenlösung, desto schneller wird es durch die Fibroblasten kontrahiert werden. Geringfügige Unterschiede in Kontraktionsrate wird mit verschiedenen Chargen von Kollagen in der gleichen Konzentration erfahren werden. Ebenso verschiedenen Fibroblasten-Kulturen wird die Kollagen-Gele mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten kontrahieren, und je mehr Fibroblasten präsentieren, desto schneller die Geschwindigkeit der Kontraktion. Kollagenkonzentration und Fibroblasten-Dichte kann daher durch angepasst, um die Rate der Kontraktion zu verändern,und die endgültige Dichte des Kollagengels. 4. Stage II – Plating Zellen von Interesse auf der Oberseite der Matrix Hinweis: Sterilisieren alle Zangen und Geräte mit Ethanol vor dem Gebrauch. Mit stumpfen Pinzette vorsichtig bewegen vertraglich Matrix 24-Well-Schale. Stellen Sie sicher, dass es nicht klappt. Bereiten Suspension von Zellen von Interesse bei etwa 4 x 10 4 / ml und Platte 1ml (nach trypsinising, Spin-Zellen loszuwerden Trypsin) auf der Oberseite der Matrix. Tatsächliche Anzahl der Zellen benötigt variiert je nach Zelltyp. Zellmedium sollte normalen Wachstumsmedium für die Zellen von Interesse sein. Erlauben Zellen bis zur Konfluenz auf der Matrix, etwa 3-5 Tage wachsen gelassen. 5. Stufe III – Übertragung der Matrix auf einem Raster für die Invasion (ca. 0-21 Tage) Cut Edelstahlgitterroste ein Stativ zu schaffen und autoklavieren vor der Anwendung (siehe Abbildung 2). Zeigen sterile Gitter6 cm Schale, fügen Wachstumsmedium bis zu einem Niveau oberhalb des Gitters (ca. 10.5ml). Matrix Platz auf dem Gitter und sanft absaugen Medien so dass die Unterseite der Matrix in Kontakt mit den Medien, aber nicht getaucht. Dies wird als die Luft / Flüssigkeits-Schnittstelle, die einen Gradienten, Invasion fördert schafft bezeichnet. Ersetzen Medium alle zwei Tage (siehe Abbildung 2). Live-Zelle kann kontextuellen Bildgebung mit fluoreszierenden Zellen zu diesem Zeitpunkt oder früher abgebildet werden. Die kontrahierten oder fibrillären Kollagen kann ich abgebildet mit Second Harmonic Generation (SHG, siehe Abbildung 3). Mittels Multi-Photonen-Anregung mit großem Feld Detektion kombinierten wir feststellen, dass SHG mindestens 100 um in die Matrix abgebildet werden, wohingegen Zellen, die GFP cytoplasmatischen abbildbar mindestens 200 um tief sein. Hinweis: Im Hinblick auf die Quantifizierung der Invasion, definiert der Tag, an dem Matrizen auf den Gittern platziert werden Tag 0. Platzierung auf Gittern einen Gradienten von Zellkulturmedien, die Invasion int fördert o die Matrix. Die Proben können in den nächsten 1 abgebildet werden – 21 Tage (oder länger) an biologischen Prozessen wie Invasion, Proliferation, Überleben oder Differenzierung (siehe Referenzliste) zu beurteilen. 6. Stufe IV – Fixation 5 ml 4% PFA in einem Falcon-Röhrchen. Übertragen Sie die Matrix auf eine ebene Fläche. Schneiden Sie die Matrix in zwei Hälften mit einem frischen, sauberen Skalpell (wie werden Sie Färbung der Querschnitt), heben Sie die Matrix mit Skalpell und Transfer zum 4% PFA, fix über Nacht. Organotypische Matrizen sind nun bereit, mit dem Antikörper färben / Fleck der Wahl (siehe Abbildung 3). 7. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1 Beispiel Fibroblasten vergeben Kollagen I. Mischung aus Fibroblasten und Rattenschwanz Kollagen aus der Petrischale gelöst und erlaubt, über 6-8 Tage schrumpfen. Abbildung 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/> Abbildung 2 Organotypische Assay Progression. Eine schematische organotypischer Einrichtung und Progression. B, Beispiel von Kollagen / Fibroblasten-Matrix auf der Oberseite Edelstahl, sterilen Gitters, um Luft / Flüssigkeits-Grenzfläche zu schaffen. Abbildung 3 Anwendungen organotypischer Assay. A, B eindringenden nichtinvasiven und invasiven duktalen Adenokarzinom (PDAC) Zellen im Laufe der Zeit mit organotypischen Matrix. C, lebenden Hautäquivalent, das eine geschichtete Epidermis eines Fibroblasten vergebene kollagenen dermalen Komponente. D, eindringenden C8161 Melanomzellen in einem Fibroblast -Vertrag kollagenen dermal gleichwertig. E, invasive PDAC Zellen (grün) interagieren und Invasion mit Fibroblasten (rot) in der organotypischen Matrix. F </strong>, visualisiert invasive PDAC Zellen (grün), die mit einer entwürdigenden Umgebung extrazellulären Matrix (violett) mit Multiphotonen-basierte Erzeugung der zweiten Harmonischen.