İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Kesitler boyanması Mumunu gidermek, her 5 dakika için 3x Ksilen (Fisher X3 G -4) ile slayt (kullanıma bağlı olarak her ay değişikliği ksilen, ksilen ZEHİRLİ) . Fisher ref 08-812-1A ve raflar 20 slaytlar için yemekleri ve kapakları kullanın bu yemekler uygun yaptı. Başına 200 ml sıvı bulaşık. (Her 2 haftada bir değiştirmek degrade) aşağıdaki gibi alkol degrade ile Hidrat: % 100 etanol (Fisher # A406-20) her biri için 2 dakika içinde 2x % 95 etanol içinde her biri 2 dakika 2x 2 dakika süreyle% 70 etanol 1x 1x 2 dakika süreyle% 50 etanol 1x 2 dakika süreyle% 30 etanol 1x 2 dakika süreyle GKD 2 O DPBS 5 dakika boyunca yıkayınız (DPBS = Dulbecco'nun modifiye Fosfat Ca 2 Tamponlu Salin + ve Mg 2 +). Antijen kurtarma: Mikrodalga ısı Öncesi Na-sitrat tamponu (10 mM, pH 6.5). Slaytlar mikrodalga fırında 15 dakika pişirin. Slaytlar böylece her dakika kontrol etmek ve gerektiğinde Na-Sitrat eklemek kuru asla. Oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Endojen peroksidaz aktivitesini engellemek% 1 20 dakika DPBS H 2 O 2 (% 30 hisse senedinin 1,5 ml, 50 ml DPBS Sigma H-1009) . DPBS 3 x 5 dakika bekletin. +4 ° C DPBS +% 5 sığır serum albumini (BSA) +% 0.1 Na Azid +% 5 serum gece inkübe non-spesifik siteler engelleyin. Not: serum Choice boyanması için kullanılan antikorların yapıldığı türler bağlıdır. Ikincil Ab (biotin konjuge) yapıldığı türler serum ile engelleyin. Bu mevcut değilse, birincil Ab yapıldığı olandan farklı bir tür serum kullanın. Avidin / biotin engelleme kiti (Vektör laboratuarlar katalog # SP-2001) ile biotin siteler Blok: Avidin D 15 dakika inkübe edin. DPBS kısaca durulayın. Biotin çözümü ile 15 dakika inkübe edin. DPBS oda sıcaklığında 2 saat, BSA +% 2 +% 0.1 NaAzide +% 2 serum (adım Engelleme aynı) için birincil Ab inkübe edin. PBS 3 x 5 dakika bekletin. DPBS içinde oda sıcaklığı +% 2 BSA +% 0.1 Na Azid +% 2 serum (engelleme adım için kullanılan aynı). Az 1 saat biotin ile konjuge ikincil Ab ile inkübe Kullanmadan önce en az 30 dakika süreyle geliştirmek zorundadır, çünkü aynı zamanda ABC reaktif hazırlayın! (Malzeme bakınız) 50 ml konik bir tüp içinde hazırlayın. 15 ml DPBS (hiçbir serum, azid) reaktif 3 damla ekleyin, karıştırın ve 3 damla reaktif B ve karışımı ekleyin. Şişe sıkma kaçının yerine, kendi form damla bekleyin. Vektör Labs ABC kiti Vectastain PK-6100. DPBS 3 x 5 dakika bekletin. Oda sıcaklığında 30-45 dakika ABC reaktifi ile inkübe edin. DPBS 3 x 5 dakika bekletin. (Malzeme) kullanmadan önce hemen bir cam flakon, 5 ml GKD 2 O (Vektör Labs # SK-4100) DAB peroksidaz substrat hazırlayın 2 damla tampon stok solüsyonu, mix DAB 4 damla, mix (hafif kahverengi haline gelmelidir) 2 damla H 2 O 2, mix Bırak slaytların üstünde DAB yüzey ve kahverengi lekelere izlemek. Buz içine batırın slaytlar + reaksiyonu durdurmak için su dokunun. 5 dakika boyunca soğuk su altında durulayın. Hematoksilen (20 sn; Fisher CS401-D) ile Counterstain ve su temizlemek gelene kadar musluk suyunda yıkayın. Alkol degrade% 100 etanol (2 dk)% 30 etanol ile dehydrate. Ksilen 3 x 5 dakika bekletin. Permount Mount (Fisher # SP15-100): slaytta yukarıdaki bölüm koymak ve hava kabarcıkları olmadan bir bölümü ile lamel üzerine yavaşça basın. ~ 24 saat sürer, tamamen kuruyana kadar lamel hareket etmeyin.