المناعية : أقسام البارافين باستخدام ABC Vectastain مجموعة من مختبرات المتجهات
Abstract
المناعية (IHC) هي تقنية تستخدم لحصر قيمة / تصور بروتين تعبير في قسم الأنسجة المركبة باستخدام الاجسام المضادة المحددة. هناك طريقتين : الطريقة المباشرة وغير المباشرة. في هذه التجربة ، فإننا سوف تصف فقط استخدام تلطيخ IHC غير المباشرة. IHC غير المباشرة تلطيخ يستخدم محددة للغاية الأضداد الابتدائي والثانوي والبيوتين مترافق. وتستخدم الأجسام المضادة الأولية لتحديد البروتينات بتحفظ الاهتمام من جانب ملزم لحاتمة محددة ، في حين أن الأجسام المضادة الثانوية طرح لتلوين الخلفية غير محددة وتضخيم إشارة من خلال تشكيل المجمعات إلى الضد الابتدائي. إما أن تكون شرائح المتولدة من الفروع المجمدة ، وجزءا لا يتجزأ من البارافين أو المقاطع التي شنت على الشرائح الزجاجية. في هذا البروتوكول ، نناقش إعداد المقاطع البارافين مضمن بواسطة الماء ، dewaxing باستخدام التدرج الكحول ، واسترجاع الحرارة الناجمة عن مستضد ، وعرقلة النشاط البيروكسيداز المحلية والمنظمات غير محددة المواقع ملزمة. هي ملطخة ثم بعض المقاطع مع الأجسام المضادة المحددة للعلامة الخلايا التائية CD8 وبينما البعض الآخر لالملون هيدروكسيلاز التيروزين. بعد ذلك يتم التعامل مع الشرائح الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمترافق البيوتين ، ثم تطورت باستخدام أفيدين – مترافق البيروكسيداز الفجل (HRP) مع Diaminiobenzidine (DAB) والركيزة. التالية التنمية ، هي counterstained الشرائح للالنقيض من ذلك ، والتي شنت تحت coverslips مع permount. بعد تجفيف كافية ، وهذه الشرائح هي ثم جاهزة للتصوير.
Protocol
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Xylene | Fisher | X3S-4 | Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC. | |
| 100% ethanol | Fisher | A406-20 | Use to make EtOH gradient. | |
| DPBS | Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+ | |||
| Na-Citrate buffer | 10 mM, pH 6.5 | |||
| H2O2 | Sigma | H-1009 | 30% stock => Dilute to 1% in DPBS | |
| Blocking solution | DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. | |||
| BSA | ||||
| Sodium Azide | NaAzide | |||
| avidin/biotin blocking kit | Vector laboratories | SP-2001 | ||
| Ab buffer | DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step) | |||
| ABC kit Vectastain PK-6100 | Vector Laboratories | |||
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | ||
| ddH2O | ||||
| Hematoxylin | Fisher | CS401-D | counterstain | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | ||
| Slides and cover-slips | glass |
