Immunhistochemie: Paraffin Schnitte mit der Vectastain ABC Kit von Vector Labs

Färbung von Paraffinschnitten Entparaffinieren Objektträger mit Xylol (Fisher X3 S -4) 3x für jeweils 5 Minuten (change Xylol jeden Monat je nach Nutzung, ist Xylol TOXIC). Verwenden Sie Geschirr und Deckel für 20 Dias von Fisher ref 08-812-1A und Racks, um diese Gerichte passen. 200 ml Flüssigkeit pro Gericht. Hydrate durch Alkohol Gradienten wie folgt (Änderung Gradienten alle 2 Wochen): 2x in 100% Ethanol (Fisher # A406-20) für je 2 min 2x in 95% Ethanol für 2 min jeweils 1x in 70% Ethanol für 2 min 1x in 50% Ethanol für 2 min 1x in 30% Ethanol für 2 min 1x ddH 2 O für 2 min Tauchen Sie ein in DPBS für 5 min (DPBS = Dulbecco modifiziertem Phosphate Buffered mit Ca 2 + Saline und Mg 2 +). Antigen Erholung: Heizen Sie den Na-Citrat-Puffer (10 mM, pH 6,5) in die Mikrowelle. Kochen Sie die Folien für 15 min in der Mikrowelle. Die Folien sollten nie trocken, so prüfen jede min und fügen Na-Citrat, wenn nötig. Lassen Sie bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Block endogene Peroxidase-Aktivität mit 1% H 2 O 2 in DPBS für 20 min (1,5 ml 30% Lager Sigma H-1009 in 50 ml DPBS). Tauchen Sie ein in DPBS 3 x 5 min. Block nicht-spezifische Websites durch Inkubation über Nacht bei +4 ° C in DPBS + 5% Rinderserumalbumin (BSA) + 0,1% Na-Azid + 5% Serum. Hinweis: Wahl der Serum wird auf die Arten, bei denen Antikörper für die Färbung verwendet wurden abhängen. Block mit Serum von Spezies, bei denen die sekundäre Ab (konjugiert an Biotin) gemacht wurde. Wenn dieses nicht verfügbar ist, verwenden Serum aus einer Spezies unterscheidet sich von demjenigen, in dem die primäre Ab gemacht wurde. Blockieren Sie die Biotin-Sites mit dem Avidin / Biotin-Blocking-Kit (Vector Laboratories Katalog # SP-2001): Inkubieren mit Avidin D für 15 min. Spülen Sie kurz mit DPBS. Inkubieren mit dem Biotin-Lösung für 15 min. Inkubieren in primären Ab 2 Stunden bei Raumtemperatur in DPBS + 2% BSA + 0,1% NaAzide + 2% Serum (wie bei Blocking Schritt). Tauchen Sie ein in PBS 3 x 5 min. Inkubieren mit dem sekundären Ab mit Biotin konjugiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur in DPBS + 2% BSA + 0,1% Na-Azid + 2% Serum (wie für die Sperrung Schritt verwendet). Bereiten Sie ABC-Reagenz zur gleichen Zeit, weil sie für mindestens 30 min vor Gebrauch zu entwickeln hat! (Siehe Materialien) Bereiten Sie in einem 50 ml konischen Rohr. In 15 ml DPBS (kein Serum, kein Azid) 3 Tropfen Reagenz A, mischen und mit 3 Tropfen Reagenz B und mischen. Vermeiden Sie das Drücken der Flaschen, sondern für die Tropfen warten, um auf ihre eigene Form. ABC-Kit Vectastain PK-6100 von Vector Labs. Tauchen Sie ein in DPBS 3 x 5 min. Inkubieren mit ABC-Reagenz für 30-45 min bei Raumtemperatur. Tauchen Sie ein in DPBS 3 x 5 min. Bereiten DAB Peroxidase Substrat (Vector Labs # SK-4100) in 5 ml ddH 2 O in einem Glasfläschchen unmittelbar vor der Verwendung (siehe Materialien) 2 Tropfen Puffer-Stammlösung mischen 4 Tropfen DAB, mischen (sollte sich leicht braun) 2 Tropfen H 2 O 2, mix Löschen Sie die DAB-Substrat auf der Oberseite des Dias und achten Sie auf braune Flecken. Dip Slides in Eis + Wasser, um die Reaktion zu stoppen. Spülen Sie mit kaltem Leitungswasser 5 min. Gegenfärbung mit Hämatoxylin (20 sec; Fisher CS401-D) und spülen in Leitungswasser bis das Wasser kommt aus klar. Entwässern durch Alkohol Gefälle ab 30% Ethanol bis zu 100% Ethanol (2 Min.). Tauchen Sie ein in Xylol 3 x 5 min. Berg mit Permount (Fisher # SP15-100): put einige über dem Abschnitt auf der Folie und drücken Sie langsam auf den Abschnitt mit einem Deckglas ohne Luftblasen. Bewegen Sie sich nicht das Deckglas, bis sie vollständig trocken, was dauert bis 24 Stunden.