Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia</em

1. Fragmento de tronco de la regeneración de ensayo Dejar de alimentar a un grupo de gusanos por lo menos 5 días antes del ensayo de regeneración de asegurar que los animales están libres de residuos y de los alimentos ingeridos (~ 30 gusanos intactos, cada gusano ~ 10.8 mm de largo después de la hambruna). En el día de la prueba, un enjuague pre-congelados plato nivelado de hielo con agua y cubrir la superficie plana de helado con una envoltura de plástico. Con unas pinzas, un lugar de papel de filtro en la envoltura de plástico. Humedezca el papel de filtro con unas gotas de agua de manantial. Transferencia de planarias en filtro (<20 gusanos por filtro) con una pipeta de transferencia. Los gusanos pueden volver a colocarse en el filtro, si es necesario, por repipetting con agua de manantial más. Retire el exceso de líquido. El uso de un bisturí, amputar la cabeza de un solo corte realizado aproximadamente a medio camino entre el vértice anterior del animal y el extremo anterior de la faringe (Figura 1). El uso de un bisturí, amputar la región de la cola de un solo corte realizado aproximadamente a medio camino entre el extremo de la cola del animal y el extremo posterior de la faringe (Figura 1). Retire el exceso de mucosidad en el bisturí con una toalla de papel humedecida con alcohol al 70% después del corte. Limpie el exceso de etanol a partir de bisturí. Transferencia del filtro a través de unas pinzas en una placa de Petri (100 x 25 mm de profundidad), que contiene agua de manantial. Espere ~ 3 minutos (para el cierre de la herida, observable por un pellizco y oscurecimiento de la herida). Enjuague fragmentos del tronco de papel de filtro en una placa de Petri que contienen medio deseado para el ensayo de regeneración y traslado al termostatizado incubadora (24 ° C). Puntuación fenotipo de regeneración después de aproximadamente una semana, cuando las estructuras regeneradas son identificables (Figura 1). 2. La manipulación farmacológica de la regeneración: la bipolaridad inducida por praziquantel Prepare praziquantel (PZQ) de stock de medicamentos de solubilización en DMSO (62.4mg PZQ en 1 ml de imágenes de stock 200 mM). Utilice el mismo día. Hacer 50 ml de solución que contiene el fármaco (90 M PZQ) en sales Montjuch búfer. Vortex de ~ 1 minuto para asegurar la dispersión. Realizar análisis tronco fragmento regenerativa como se detalla anteriormente [protocolo n º 1], la exposición de una cohorte de fragmentos del tronco para PZQ en la etapa final [1,7]. Después de 24-48 horas, cambio de PZQ que contienen los medios de comunicación para el agua de manantial, el lavado de varios gusanos (> 3) veces. Volver gusanos a la incubadora. Bipolaridad puntuación (de dos cabezas, Figura 1B) una semana después del corte. 3. La manipulación genética de la regeneración: en el protocolo de alimentación vivo ARNi Antes del ensayo, preparar homogeneizado de hígado de pollo. Deseche las secciones grasos, de color amarillo de foodstock, y el hígado puré restante. Filtro de puré a través de colador de malla y la suspensión alícuota para el almacenamiento (1,5 ml tubos, -20 ° C). Antes del ensayo, preparar bovina glóbulos rojos (GR) en alícuotas de suministro en las muestras de 1 ml, almacenados a -20 ° C. Seleccione los gusanos de RNAi. Tres cohortes se utilizan: el gen de interés, el control positivo (gen conocido con el fenotipo RNAi; Figura 1 C, D y E) de control y negativo (gen sin fenotipo RNAi, también es útil para la evaluación de los niveles de caída en comparación con cohortes experimental). Para cada cohorte, el uso ~ 250 gusanos (~ 10.8 mm de largo después de que mueren de hambre por lo menos 5 días). Tienda en agua de manantial en la bañera de plástico. Para cada población de cohortes RNAi deshielo, de E. coli que expresan genes dsRNA objetivo de interés [8], junto con un tubo de homogeneizado de hígado de pollo [3,1] y un tubo de glóbulos rojos [3,2]. Pellet bacterias (13.000 g, 1 minuto). Aspirar el sobrenadante y el pellet se resuspende en 2xYT los medios de comunicación (~ 700μl). Centrifugar, desechar el sobrenadante, el lugar de pellets en hielo. Crear un gran agujero P200 punta de la pipeta por cortar el extremo de la punta. Bien volver a suspender el sedimento bacteriano en una mezcla de homogeneizado de hígado de pollo (150 l) y los glóbulos rojos (50 l) para crear la mezcla de alimentación RNAi. Eliminar las burbujas de aire por centrifugación. Para la alimentación, retire la mayor parte del agua de la tina de plástico que contenía gusanos (dejar en profundidad ~ 1 pulgada). Tina remolino de concentrar los gusanos en el centro de este contenedor, y una pipeta de mezcla de alimentación RNAi en un círculo acorralando a los gusanos. Use una pipeta de transferencia de convencer cuidadosamente fugitivos de vuelta a la mezcla de alimentación RNAi sin perturbar otros comensales! Después de la alimentación (aproximadamente 1 hora), identificar las planarias que bien alimentados. Estos gusanos muestran una coloración roja intensa de eritrocitos ingeridos. Descartar otros. Reemplace con cuidado la alimentación de solución con agua de manantial, lo que minimiza la perturbación para evitar excreción de los alimentos. Para ello, suavemente localizar a los gusanos a un lado del tubo con una pipeta de transferencia, derrama el agua turbia, y sustituya cuidadosamente con agua dulce vertida por la pared de enfrente de la bañera. Planarias Resubmerge rápidamente como la exposición prolongada al aire también se traduce en excreción de alimentos. Libremente en síal tapón del depósito y retorno a la incubadora (24 ° C) Repita el protocolo de RNAi de alimentación en varios ciclos (~ 2-3 días de diferencia), intercalados con ciclos de regeneración [protocolo # 1] para la detección de fenotipos RNAi. Un protocolo estándar para la alimentación y la regeneración efectiva de muchos genes se muestra en la Figura 2, que lleva alrededor de un mes de duración total. Modificar este esquema de genes diferentes, como el protocolo óptimo dependerá de factores tales como la estabilidad del ARNm, la localización del tejido, pervivencia de proteínas, o el desarrollo de un fenotipo que se opone a varios ciclos de alimentación después de la regeneración. Evaluar los niveles de caída, simplemente la detección de la penetrancia del fenotipo (si es evidente), o por métodos qPCR para comparar los niveles de ARNm específicos con la cohorte de control negativo. 4. Los resultados representativos: El fragmento de ensayo de la regeneración del tronco es robusto de tal manera que todos los gusanos deben regenerarse con normalidad anterior-posterior ("cabeza a la cola") polaridad. Esto se puede marcar tan pronto como cinco días después del corte, facilitado por la aparición de las manchas oculares anterior (asterixed, Figura 1). Sin embargo, la completa restauración morfológica de estructuras perdidas se produce después de una semana. La manipulación farmacológica de la regeneración del tronco fragmento PZQ para producir dos cabezas gusanos (fig. 1B) también es robusto (CE 50 = 87 (+ -) 11% fragmentos bipolar, 70μM PZQ durante 48 horas 20). La bipolaridad se produce en un ciclo regenerativo único. Menor eficacia en estos ensayos es probable se relaciona con problemas con la solubilidad del fármaco y / o almacenamiento, o el uso de una especie de gusano plano diferente, donde PZQ es ineficaz. Para los medicamentos con menor penetrancia, un índice anteriorización se utiliza a menudo para marcar fenotipos intermedios, aparte de 22 bipolaridad completa. Fenotipos resultantes de RNAi de las construcciones de control positivo se muestra en la Figura 1: RNAi de Dugesia japonica seis-1 (D j-seis-1) resulta en un fenotipo sin ojos 23 (fig. 1C), RNAi de Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) resulta en una pérdida de la respuesta de aversión luz 24 (Figura 1D) y de RNAi Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) resulta en un fenotipo de dos cabezas 16-19, 21 a partir de fragmentos del tronco (Figura 1). Estos fenotipos se puede lograr utilizando los siguientes protocolos de RNAi sencilla: Dj-seis-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), donde F = ciclo de alimentación y x = ciclo regenerativo, respectivamente. Figura 1:… Fragmento del tronco ensayo de regeneración de la izquierda, imagen de la planaria (arriba) y esquema (centro) para mostrar la ubicación de un fragmento de tronco derecho extirpado, timecourse de la regeneración del tronco fragmento que muestra la apariencia de un fragmento de la regeneración en el momento indicado (días) B Imagen de dos cabezas planaria producida por la exposición PZQ. "Ciega" C gusano producido por Dj-seis-1 RNAi. Pérdida D de la respuesta de aversión luz inmóvil gusanos Dj-PC2 RNAi (manchas rojas), en comparación con el gusano de control móvil (manchado verde). E bipolar planaria producido por Dj-βcatenin-1 RNAi. En Bélgica, el final original anterior de los gusanos de RNAi se orienta hacia la izquierda. Figura 2: Secuencia de la alimentación y ciclos de corta de protocolo típico de RNAi que comprende alimentación múltiple (F), y los ciclos de regeneración (x) que es eficaz para la caída de muchos genes en D. japonica. La modificación de este protocolo para los distintos genes pueden ser necesarios para obtener resultados óptimos, por ejemplo mediante un archivo. Menos (entre paréntesis) o un número mayor de alimentación y los ciclos de regeneración