فحوصات الوراثية الدوائية وظيفية للتلاعب تجديد مستورقة Dugesia تفرضه اليابان</em
Summary
نموذج لدراسة جاذبية تمايز الخلايا الجذعية داخل الحيوانات الحية هي دودة مسطحة مستورقة. هو درس تجارب التجديد التي بتر بسيطة التي يتم تنفيذها بسهولة في المختبر الأساسية وقابلة لل(والدوائية الجينية<em> في الجسم الحي</em> رني) التلاعب على النحو الذي فصله البروتوكولات في هذه المقالة.
Abstract
الديدان المفلطحة مستورقة حرة المعيشة لديهم تاريخ طويل من الاستخدام التجريبي نظرا لقدراتهم على التجدد ملحوظة 1. شظايا صغيرة استئصاله من هذه الحيوانات خطة إصلاح الجسم الأصلي بعد تجديد هياكل الجسم في عداد المفقودين. على سبيل المثال إذا تم قطع جزء أ "الجذع" من دودة سليمة ، 'رئيس' جديد وتجديد الأمامية و"الذيل" سيتم تجديد خلفي استعادة الأصلي الاقطاب "من الرأس إلى الذيل" لهياكل الجسم قبل بتر (الشكل 1A).
والدافع التجدد بواسطة الخلايا الجذعية مستورقة ، والمعروفة باسم 'neoblasts" التي تفرق في ~ 30 أنواع مختلفة من الخلايا خلال توازن الجسم الطبيعي والقسري تجديد الأنسجة. هذه العملية هي التجدد قوية وسهلة في التظاهر. وقد تم الآن نظرا لتفاني مختبرات رائدة عدة ، العديد من الأدوات والأساليب الوراثية وظيفية الأمثل لهذا النظام النموذجي. وبالتالي ، فقد تم إحراز تقدم كبير في الآونة الأخيرة الفهم والتلاعب في الأحداث الجزيئية التي تقوم عليها اللدونة التنموية مستورقة 2-9.
سيقوم النظام نموذج مستورقة تكون ذات فائدة لمجموعة واسعة من العلماء. للعلماء الأعصاب ، والنموذج يتيح الفرصة لدراسة تجديد نظام العصبي بأكمله ، بدلا من مجرد. إعادة نمو / إصلاح عملية الخلايا العصبية واحد التي عادة ما تكون محور الدراسة في العديد من النماذج القائمة Planarians أعرب عدد كبير من الناقلات العصبية 10 ، تمثل نظاما هاما لدراسة تطور الجهاز العصبي المركزي 11 و 12 و السلوكية المحتملة والفرز 13 و 14.
التجدد نتائج قابلة للتلاعب من جانب apparoaches والدوائية الجينية. على سبيل المثال ، يمكن فحص المخدرات للآثار على التجدد ببساطة عن طريق وضع أجزاء الجسم التي تحتوي على المخدرات في حلول في نقاط زمنية مختلفة بعد البتر. ويمكن دراسة دور الجينات الفردية باستخدام أساليب ضربة قاضية ([رني في الجسم الحي) ، والتي لا يمكن أن يتحقق إما من خلال دورات microinjection أو عن طريق تغذية البكتريا ، وأعرب يبني الرنا المزدوج الجديلة 8 ، 9 ، 15. يمكن أن تنتج كلا النهجين الظواهر ضرب بصريا في انتفاذ عالية من أجل التجديد ، ومثال على الحيوانات القطبية الثنائية 16-21. لتسهيل اعتماد هذا النموذج وتنفيذ مثل هذه الأساليب ، عرض علينا في هذه المقالة بروتوكولات الفيديو لفحوصات والدوائية الجينية (في الجسم الحي عن طريق تغذية رني) باستخدام Dugesia مستورقة تفرضه اليابان.
Protocol
1. مقايسة الجذع جزء التجدد وقف التغذية لفيف من الديدان لمدة لا تقل عن 5 أيام قبل الفحص لضمان التجدد الحيوانات خالية من النفايات والمواد الغذائية المستهلكة (~ 30 الديدان سليمة ، كل دودة ~ 80-10 مم في مرحلة ما بعد الموت جوعا). في يوم من الفحص ، وشطف مسبقا المجمدة طبق الجليد تعادل مع المياه وتغطية سطح مستو المثلج مع غلاف بلاستيكي. باستخدام الملقط ، مكان واحد ورقة تصفية على غلاف بلاستيكي. بلل ورقة الترشيح مع بضع قطرات من مياه الينابيع. نقل planarians على تصفية (<20 الديدان لكل مرشح) باستخدام ماصة نقل. ويمكن تعديل أوضاعها الديدان على التصفية ، إذا اقتضى الأمر ، مع المزيد من المياه repipetting الربيع. إزالة السوائل الزائدة. باستخدام مشرط ، بتر رأسه مرة واحدة من قطع منتصف الطريق تقريبا بين قمة الأمامي من الحيوان ونهاية الأمامي من البلعوم (الشكل 1A). باستخدام مشرط ، بتر منطقة الذيل من قبل مرة واحدة من قطع تقريبا في منتصف الطريق بين ذيل الحيوان ونهاية الخلفي من البلعوم (الشكل 1A). إزالة المخاط الزائد على مشرط باستخدام منشفة ورقية مبللة الايثانول 70 ٪ بعد عدة قطاعات. يمسح الايثانول الزائدة من مشرط. نقل عن طريق تصفية ملقط في طبق بيتري (100 × 25mm العمق) التي تحتوي على مياه الينابيع. انتظر ~ 3 دقائق (لإغلاق الجرح ، يمكن ملاحظتها من قبل معسر وسواد الجرح). شطف شظايا الجذع من ورق الترشيح في طبق بتري تحتوي على المتوسط المطلوب للمقايسة التجدد ونقلها إلى الحاضنة thermostatted (24 درجة مئوية). النمط الظاهري درجة التجدد بعد أسبوع 1 ~ ، عندما هياكل المجددة يمكن تمييزها (الشكل 1A). 2. الدوائية التلاعب التجدد : القطبية الثنائية التي تحدثها البرازيكوانتيل إعداد البرازيكوانتيل (PZQ) الأسهم المخدرات في solubilizing DMSO (62.4mg PZQ في 1mL عن الأسهم 200MM). استخدامها في نفس اليوم. جعل 50mL من المخدرات التي تحتوي على حل (90 PZQ ميكرومتر) في الأملاح Montjuch مخزنة. دوامة لمدة دقيقة 1 ~ لضمان التشتت. إجراء فحص الجذع جزء التجدد على النحو المفصل أعلاه [البروتوكول رقم 1] ، وفضح لفيف من الجذع إلى شظايا PZQ في الخطوة النهائية [1،7]. بعد 24-48 ساعة ، وتبادل PZQ التي تحتوي على وسائل الإعلام لمياه الينابيع ، وغسل الديدان عديدة (> 3) مرات. عودة إلى حاضنة الديدان. درجة الاستقطاب الثنائي (اثنان من الرؤساء ، 1B الشكل) بعد أسبوع واحد القطع. 3. التلاعب الجيني للتجديد : المجراة بروتوكول التغذية رني قبل الفحص ، وإعداد الدجاج جناسة الكبد. تجاهل والأصفر الدهنية المقاطع الملونة من foodstock ، وبوريه الكبد المتبقية. تصفية بوريه من خلال مصفاة شبكة وتعليق قسامة للتخزين (1.5mL أنابيب ، -20 درجة مئوية). قبل الفحص ، وإعداد البقري خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) من خلال العرض aliquoting في عينات 1mL وتخزينها في -20 درجة مئوية. حدد الديدان لرني. وتستخدم ثلاثة أفواج : الجينات في المصالح ، والسيطرة الايجابية (الجينات مع النمط الظاهري رني المعروفة ؛ الشكل 1C ، D & E) والسلبية التحكم (مع عدم وجود جينات النمط الظاهري رني ، مفيدة أيضا لتقييم مستويات ضربة قاضية مقارنة مع الأتراب التجريبية). لكل فوج ، واستخدام الديدان ~ 250 (~ 80-10 ملم بعد فترة طويلة من الجوع ما لا يقل عن 5 أيام). تخزين المياه في فصل الربيع في حوض من البلاستيك. لكل سهم الفوج رني ذوبان الجليد ، من التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة كولاي استهداف الجينات في المصالح [8] ، جنبا إلى جنب مع أنبوب جناسة كبد الدجاج [3،1] ، وأنبوب من كرات الدم الحمراء [3،2]. بيليه البكتيريا (13،000 غرام ، 1 دقيقة). إزالة وطاف بيليه resuspend في وسائل الإعلام 2xYT (~ 700μl). Recentrifuge ، تجاهل طاف ، بيليه مكان على الجليد. إنشاء كبيرة تحمل الطرف ماصة P200 بقطع نهاية الحافة. resuspend بدقة بيليه البكتيرية في خليط من الدجاج جناسة الكبد (150 ميكرولتر) وكرات الدم الحمراء (50 ميكرولتر) لإنشاء رني مزيج التغذية. إزالة فقاعات الهواء عن طريق الطرد المركزي. للتغذية ، وإزالة معظم الماء من الحوض البلاستيك تحتوي على الديدان (إجازة ~ عمق 1 بوصة). الحوض دوامة التركيز الديدان في مركز هذه الحاوية ، وماصة مزيج التغذية رني في دائرة احتضان الديدان. استخدام ماصة نقل بعناية لاقناع الهاربين ليعيدوه الى مزيج التغذية رني دون تكدير بالرواد أخرى! بعد الرضاعة (~ 1 ساعة) ، وتحديد planarians التي تتغذى بشكل جيد. هذه الديدان تظهر تلوين أحمر عميق من كرات الدم الحمراء بلعها. تجاهل الآخرين. استبدال بعناية التغذية حل مع مياه الينابيع العذبة ، والحد من الاضطرابات لمنع ابتراز من المواد الغذائية. للقيام بذلك ، توطين بلطف الديدان إلى جانب واحد من أنبوب نقل باستخدام ماصة ، تتدفق المياه العكرة ، واستبدال بعناية مع سكب المياه العذبة باستمرار على الجدار المقابل للحوض. planarians Resubmerge بأسرع وقت التعرض لفترة طويلة في الهواء ايضا في نتائج ابتراز الغذاء. فضفاضة حد ذاتهابن غطاء الحاوية والعودة إلى الحاضنة (24 درجة مئوية) كرر رني بروتوكول التغذية على مدى دورات متعددة (~ 2-3 أيام بعيدا) ، تتخللها دورات التجدد [بروتوكول # 1] للكشف عن الظواهر رني. ويرد بروتوكول قياسي لتغذية وتجديد فعالة لجينات كثيرة في الشكل 2 ، والتي تأخذ في الشهر ~ 1 المدة الإجمالية. تعديل هذا النظام لجينات مختلفة ، وبروتوكول الأمثل سوف يعتمد على عوامل مثل الاستقرار مرنا والتطويع اللغوي الأنسجة ، perdurance البروتين ، أو وضع النمط الظاهري الذي يحول دون تغذية دورات متعددة بعد التجديد. تقييم مستويات ضربة قاضية لمجرد فحص بواسطة انتفاذ من النمط الظاهري (إذا كان واضح) ، أو عن طريق نهج qPCR لمقارنة مستويات مستهدفة مرنا مع أتراب السيطرة السلبية. 4. ممثل النتائج : تجديد جزء مقايسة جذع قوي مثل الديدان وينبغي أن كل تجديد مع ('الرأس الى الذيل') العادي الأمامي الخلفي قطبية. يمكن أن يكون سجل هذا في أقرب وقت بعد خمسة أيام من القطع ، التي سهلت ظهور eyespots الأمامي (asterixed ، الشكل 1A). ومع ذلك ، واستعادة كامل للهياكل شكلية فقد تحدث بعد أسبوع واحد. التلاعب الدوائية للتجديد جزء الجذع بواسطة PZQ الاستسلام برأسين الديدان (1B الشكل) هو أيضا قوية (EC 50 = 87 (+ –) 11 ٪ شظايا القطبين ، 70μM PZQ لمدة 48 ساعة 20). الثنائية القطبية يحدث أكثر من دورة واحدة على التجدد. أقل فعالية في هذه المقايسات المرجح أن يتصل مع قضايا المخدرات والذوبان / أو تخزين ، أو استخدام أنواع مختلفة حيث PZQ دودة مسطحة غير فعالة. على المخدرات مع انخفاض انتفاذ ، وغالبا ما يستخدم مؤشر anteriorization ليسجل الظواهر وسيطة من 22 جانبا القطبية الثنائية كاملة. وترد الظواهر الناتجة عن رني بنيات مراقبة إيجابية في الشكل 1 : [رني من ستة Dugesia تفرضه اليابان 1 (د ي ستة – 1) ينتج النمط الظاهري بلا عيون 23 (الشكل 1C) ، [رني من PC2 Dugesia تفرضه اليابان (DJ – PC2) ينتج عن ذلك خسارة للاستجابة النفور من الضوء 24 (1D الشكل) ورني من Dugesia تفرضه اليابان βcatenin – 1 (DJ – βcatenin – 1) النتائج في النمط الظاهري برأسين 16-19 ، و 21 شظايا من الجذع (الشكل 1E). ويمكن تحقيق هذه الظواهر باستخدام بروتوكولات رني البسيطة التالية : DJ ستة – 1 (FFxFx) ، DJ – PC2 (FFFx) ، DJ – βcatenin – 1 (FFxFx) ، حيث F = دورة التغذية و x = دورة التجدد على التوالي. الشكل 1 :… مقايسة جذع تجديد جزء من اليسار ، صورة من مستورقة (أعلى) والتخطيطي (وسط) لإظهار موقع يستأصل جزء الجذع إلى اليمين ، timecourse التجدد جزء الجذع تظهر مظهر جزء تجديد في بعض الأحيان وأشار (أيام) B صورة برأسين مستورقة التي تنتجها التعرض PZQ جيم "بلا عيون" الدودة التي تنتجها دي جي ستة – 1 [رني ملطخة D فقدان استجابة النفور في ضوء متحرك الديدان رني DJ – PC2 (الحمراء الملطخة) ، مقارنة ب دودة التحكم المحمول (. الأخضر). E القطبين مستورقة التي تنتجها DJ – βcatenin – 1 [رني. في BE ، نهاية الأصلي الأمامي من الديدان رني يتجه إلى اليسار. الشكل 2 : تسلسل التغذية والقطع دورات لبروتوكول نموذجي رني تضم عدة رضعات (F) ، ودورات التجدد (س) التي هي فعالة لضربة قاضية في العديد من الجينات D. تفرضه اليابان. قد تكون هناك حاجة لتعديل هذا البروتوكول عن الجينات الفردية لتحقيق نتائج أفضل ، على سبيل المثال باستخدام. أقل (قوسين) أو عدد أكبر من الدورات والتغذية التجدد
Discussion
وصف البروتوكولات هنا المقايسات لدراسة التفاصيل والتلاعب تجديد Dugesia مستورقة تفرضه اليابان. فهي بسيطة ولا تتطلب مثل هذه المعدات المتخصصة التي يمكن أن أدوا بسهولة في المختبر أو في الفصول الدراسية. يمكن إجراء فحوصات بشكل فردي أو مجتمعة (للصناعات الكيماوية الفحص الجيني للefficacies المخدرات في الجسم الحي) ، ويمكن أداؤها على مستوى الجينات المرشحة ، أو هي قابلة للتكيف مع غير منحازة ، وفحص أعلى إنتاجية 8. سواء لدراسة علم الأحياء للفضول من planarians في حد ذاتها ، أو لتقييم وظيفة في الجسم الحي من المتماثلات الثدييات في نموذج بديل لدراسة تجديد الأنسجة ، ويجب أن تحفز هذه النهج الفائدة من مجموعة متنوعة من الباحثين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم العمل في المختبر من قبل قوات الامن الوطني (MCB0919933) ، والمعاهد الوطنية للصحة (GM088790).
Materials
| Reagent | Vendor | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
| 1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple vendors | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
| 2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
| Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
| Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
| Plastic tub: Ziploc Twist ‘n Loc (16oz). | Various retailers | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
| Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
| Hand Blender | Any kitchen supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
| Wire 1mm Mesh strainer | Any kitchen supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
| Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
| Circular filter papers | Whatman #3 | 1003 055 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
| Sterile, surgical blades | Multiple Vendors | n/a | |
| ±Praziquantel | Sigma Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
| Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
| Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
| Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |
References
- Morgan, T. H. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch Entwm Org. 7, 364-397 .
- Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database. Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).
- Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. Emerging patterns in planarian regeneration. Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).
- Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Agata, K., Watanabe, K. Molecular and cellular aspects of planarian regeneration. Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).
- Newmark, P. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sánchez-Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).
- Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria. Dev Cell. 8, 635-649 (2005).
- Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sánchez-Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).
- Collins, J. J. Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development. PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!. Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).
- Mineta, K. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).
- Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Emerging Model Organisms. A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals. Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).
- Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).
- Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis. Science. 319, 323-327 (2008).
- Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).
- Petersen, C. P., Reddien, P. W. Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration. Science. 319, 327-330 (2008).
- Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians. Development. 135, 1215-1221 (2008).
- Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity. PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).
- Oviedo, N. J. Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration. Dev Biol. 339, 188-199 (2010).
- Nogi, T., Levin, M. Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration. Dev Biol. 287, 314-335 (2005).
- Mannini, L. Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1. Dev Biol. 269, 346-359 (2004).
- Agata, K. Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers. Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).
Cite This Article
Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica. J. Vis. Exp. (54), e3058, doi:10.3791/3058 (2011).