Фармакологические и функциональные Генетические анализы манипулировать Регенерация планарии Dugesia японская</em

1. Магистральные фрагмент регенерации анализа Стоп кормления когорте червей, по крайней мере за 5 дней до регенеративных анализа для обеспечения животные свободны от отходов и съеденной пищи (~ 30 нетронутыми червями, каждый червь ~ 8-10 мм длиной после голодания). В день анализа, промыть предварительно замороженных выровняли лед блюдо с водой и накройте плоской ледяной поверхности полиэтиленовой пленкой. Использование щипцов, положите фильтровальную бумагу на полиэтиленовой пленкой. Смочите фильтровальная бумага с несколькими каплями родниковой водой. Передача планарий на фильтр (<20 червей на фильтр) с помощью передачи пипетки. Черви могут быть перемещены на фильтр, при необходимости, repipetting с более родниковой водой. Удалите излишки жидкости. Использование скальпеля, ампутировать голову одного отсечения примерно на полпути между передней вершина животных и переднему концу глотки (рис. 1А). Использование скальпеля, ампутировать хвост регион одним отсечения примерно на полпути между задней части животного и заднему концу глотки (рис. 1А). Удалите излишки слизи на скальпель использованием бумажным полотенцем смоченным 70% этанола после резки. Протрите избыток этанола из скальпеля. Передача через фильтр щипцов в чашку Петри (100 х 25 мм глубиной), содержащий родниковой водой. Подождите, ~ 3 минуты (для закрытия раны, наблюдаемые щипать и затемнения раны). Промыть ствол фрагменты из фильтровальной бумаги в чашку Петри содержащие желаемый средой для регенеративной анализа и передачи термостатируемый инкубатор (24 ° С). Оценка восстановительной фенотипа после ~ 1 недели, при регенерации структур могут быть идентифицированы (рис. 1А). 2. Фармакологические манипуляции регенерации: биполярности индуцированных празиквантела Подготовка празиквантел (PZQ) акции на солюбилизирующие наркотиков в ДМСО (62.4mg PZQ в 1 мл 200 мМ для акций). Использование на тот же день. Сделайте 50 мл лекарственного раствора, содержащего (90 мкМ PZQ) в буферных солей Montjuch. Vortex в течение ~ 1 минуты, чтобы гарантировать дисперсии. Выполните фрагмент ствола регенеративной анализа, как описано выше [протокол № 1], подвергая когорты магистральных фрагментов PZQ на последний шаг [1,7]. После 24-48 часов, обмен PZQ средах для родниковая вода, стиральная червей несколько (> 3) раза. Вернуться червей в инкубатор. Оценка биполярность (две головы, рисунок 1b) через неделю после резки. 3. Генетические манипуляции регенерации: в естественных условиях протокол кормления RNAi До анализа, подготовки гомогената куриной печени. Отменить жирной, желтого цвета разделы foodstock, и пюре из оставшихся печени. Фильтры пюре через сито петли и аликвоту суспензии для хранения (1,5 мл труб, -20 ° С). До анализа, подготовки бычьего красных кровяных телец (эритроцитов) путем aliquoting питания в 1 мл образцы, хранимые при температуре -20 ° C. Выбор червей для РНК-интерференции. Три когорты используются: интерес гена, положительный контроль (ген с известными фенотип RNAi, рисунок 1С, D & E) и отрицательный контроль (ген, не фенотип RNAi, также полезны для оценки нокдаун уровней по сравнению с экспериментальной группы). Для каждой когорты, используйте ~ 250 червей (~ 8-10 мм длиной после голодали в течение минимум 5 дней). Хранить в родниковую воду в пластиковые ванны. Для каждой когорте RNAi, оттепель запас E.coli, выразив дсРНК ориентации интересующего гена [8], вместе с трубкой куриного гомогената печени [3,1] и трубки эритроцитов [3,2]. Гранул бактерий (13 000 г, 1 минута). Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 2xYT СМИ (~ 700μl). Recentrifuge, отбросить супернатант, место гранул на льду. Создание большого диаметра P200 пипетки, отрезав конец наконечника. Тщательно ресуспендирования бактериальных гранул в смеси гомогената куриной печени (150 мкл) и эритроцитов (50 мкл) для создания RNAi кормления смесью. Удалить пузырьки воздуха с помощью центрифугирования. Для кормления, удаления большинства воду из пластиковой раковине под червей (оставьте ~ 1 дюйм глубины). Вихревые ванны сосредоточиться червей в центре этого контейнера, а пипетка RNAi подача смеси в кругу corralling червей. Используйте передачу пипеткой тщательно коаксиальный беглецов обратно на смесь кормления RNAi без возмущающих других посетителей! После кормления (~ 1 час), определить планарий, которые кормят хорошо. Эти черви показать глубокий красный цвет от попадании эритроцитов. Отменить другие. Тщательно заменить кормление решение с родниковой воды, сводя к минимуму нарушения, чтобы предотвратить экскреции пищи. Чтобы сделать это, мягко локализовать червей к одной стороне трубки использованием передачи пипетки вылить мутной воде, и тщательно заменить пресную воду лил противоположной стенке ванны. Resubmerge планарий быстро, как длительное пребывание на воздухе также приводит к экскреции пищи. Слабо себедр. крышкой контейнера и вернуться в инкубатор (24 ° С) Повторите RNAi кормления протокола в течение нескольких циклов (~ 2-3 дня друг от друга), чередующиеся с регенеративных циклов [протокол № 1] для выявления фенотипов RNAi. Стандартный протокол для питания и регенерации эффективным для многих генов показан на рисунке 2, который занимает ~ 1 месяца в общей продолжительности. Изменить эту схему для разных генов, а оптимального протокола будет зависеть от таких факторов, как стабильность мРНК, тканевой локализации белка perdurance, или развитие фенотипа, что исключает многократные циклы питания после регенерации. Оценка нокдаун уровней просто скрининга пенетрантностью фенотипа (если очевидно), или КПЦР подходы сравнить целевые уровни мРНК с отрицательным когорты контроля. 4. Представитель результаты: Регенерации ствол фрагмент анализа является надежной, что все черви должны регенерировать с нормальным передне-задней («голова к хвосту») полярности. Это может быть засчитан, как только через пять дней после резки, способствовало появлению передней глазных пятен (asterixed, рисунок 1А). Тем не менее, полное морфологическое восстановление утраченных структур происходит после одной недели. Фармакологические манипуляции магистральных регенерации фрагмента PZQ уступить двуглавый червей (рис. 1В) также надежная (ЕС 50 = 87 (+ -) 11% биполярных фрагменты, 70μM PZQ на 48 часов 20). Биполярность происходит в течение одного регенеративного цикла. Нижняя эффективность в этих анализах вероятно, относится к проблемам с растворимостью препарата и / или хранение или использование различных видов плоских червей, где PZQ неэффективно. Для препаратов с низкой пенетрантностью, anteriorization индекс часто используется для оценки промежуточных фенотипов в стороне от завершения 22 биполярности. Фенотипы в результате RNAi положительных конструкции управления показаны на рисунке 1: RNAi из Dugesia японской шесть-1 (D J-шесть-1) приводит к фенотипу безглазые 23 (рис. 1C), РНК-интерференции в Dugesia японской PC2 (Dj-PC2) приводит к потере света ответа отвращение 24 (Рис. 1D) и РНК-интерференции в Dugesia японской βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) приводит к двуглавый фенотип 16-19, 21 из ствола фрагментов (рис. 1E). Эти фенотипы можно достичь с помощью следующих простых RNAi протоколов: Dj-шесть-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), где F = кормления цикла и х = регенеративного цикла соответственно. Рисунок 1:… Магистральные фрагмент регенерации анализа левых, образ планарии (вверху) и схемы (в середине), чтобы показать расположение ствола вырезали фрагмент правой, timecourse магистральных регенерации фрагмент показывает появление фрагмента регенерирующим по указанной раза (в днях) B Изображение двуглавого планарии, полученных посредством воздействия PZQ. Eyeless 'C червя производства Dj шесть-1 РНК-интерференции. D потери света реакция неприятия в неподвижном Dj-PC2 RNAi червей (пятна красного цвета), по сравнению с мобильного червя контроля (витражи зеленый). E Биполярный планарии производства Dj-βcatenin-1 РНК-интерференции. В ВЕ, оригинальный передний конец RNAi червей, ориентированных на левой. Рисунок 2: Последовательность подачи и резки циклов для типичных протокол RNAi включающий несколько кормлений (F), и восстановительные циклы (х), что является эффективным для нокдаун многих генов в D. айва японская. Модификация этого протокола для отдельных генов могут быть необходимы для получения оптимальных результатов, например, используя меньше (скобки) или большее количество предметов для кормления и регенеративных циклов.