プラナリアの再生を操作するために薬理学的および機能的遺伝学的アッセイ Dugesia</em

1。トランクのフラグメントの再生アッセイ動物を確保するために再生アッセイ前に少なくとも5日間ワームのコホートを供給停止は、廃棄物や摂取した食べ物（〜30そのままワーム、それぞれのワーム〜8〜10ミリメートル長いポスト飢餓）は無料です。 検定の日に、水で事前に冷凍水平に氷皿を洗い、ラップで平らなアイス表面を覆う。鉗子を使用して、ラップで1つろ紙を置きます。 春の数滴の水でろ紙を湿ら。トランスファーピペットを使用して、フィルタ（フィルタあたり<20ワーム）の上にプラナリアを転送します。ワームは、より多くの温泉水でrepipettingで、必要に応じて、フィルタを再配置することができます。余分な水分を取り除きます。 メスを使用して、動物や咽頭の前端（ 図1A）の前方頂点間のほぼ中間に作られたシングルカットで頭部を切断する。 メスを使用して、約半分尾の動物の終わりと咽頭（ 図1A）の後端との間に作られたシングルカットで尾部を切断する。カットした後70％エタノールで湿らせたペーパータオルを使用してメスで余分な粘液を取り除く。メスから余分なエタノールを拭きます。 春の水を含むペトリ皿（100 × 25ミリメートルの深さ）にピンセットを介してフィルタを転送する。 （創縫合のための、傷のピンチと暗くによる観測）〜3分間待ちます。 ろ紙からの回生アッセイと恒温インキュベーターへの転送（24℃）の所望の培地を含むペトリ皿にトランクの断片をすすぎます。 再生の構造は（ 図1A）識別可能〜1週間後にスコアが再生表現型、。 2。プラジカンテルにより誘導される二極化：再生の薬理学的操作 DMSOに可溶化薬剤（200mmの株式に対して1mLので62.4mg PZQ）によってプラジカンテル（PZQ）株式を準備します。同じ日に使用してください。 バッファMontjuch塩の薬物含有溶液（90μMPZQ）の50mLのを確認。分散性を確保するために〜1分間ボルテックス。 最後のステップ[1.7]でPZQにトランクのフラグメントのコホートを公開する、[プロトコル＃1]上記の詳細として、トランクの断片回生アッセイを実行します。 24-48時間後に、交換PZQ含有、湧水のためのメディアをワームのいくつかの（> 3）回洗浄。 インキュベーターにワームを返します。スコアの二極化（二頭、 図1B）切断後一週間。 3。再生の遺伝子操作：in vivoでのRNAi送りプロトコルで アッセイ前に、鶏の肝臓ホモジネートを準備。 foodstockから脂肪、黄色のセクション、ピューレ、残りの肝臓を捨てる。ストレージのためのメッシュのストレーナー、アリコートの懸濁液（1.5mlのチューブ、-20 ° C）を介してフィルタピューレ。 アッセイ前に、-20℃で保存され、1mLの試料に供給を小分けでウシ赤血球（RBC）を準備する RNAiのワームを選択します。 3つのコホートが使用されています：目的の遺伝子、ポジティブコントロール（既知のRNAi表現型を有する遺伝子; 図1C、D＆E）とネガティブコントロール（無RNAiの表現型を有する遺伝子、実験的なコホートと比較してノックダウンレベルの評価にも有用）。各コホートの場合は、〜250ワームを（少なくとも5日間飢え後に長い〜8〜10ミリメートル）を使用します。プラスチック製の浴槽で温泉水に保管してください。 興味のdsRNA標的遺伝子を発現する大腸菌の各RNAiコホート、雪解けストックの[8]、鶏の肝臓ホモジネートのチューブと一緒に[3.1]と赤血球のチューブ[3.2]。 ペレット細菌（13,000 G、1分）。 2xYTメディア（〜700μl）で上清とペレットを再懸濁しますを削除します。 Recentrifugeは、氷の上清、場所ペレットを捨てる。 チップの先端をカットすることで大口径P200のピペットチップを作成します。徹底的にRNAiの供給ミックスを作成するために鶏肝臓ホモジネート（150μL）と赤血球（50μL）の混合物で、細菌ペレットを再懸濁します。遠心により気泡を取り除きます。 給餌の場合は、ワームを（〜1インチの深さを残す）を含むプラスチックの浴槽からの水の大部分を取り除く。このコンテナの中心にワームを集中させるスワール浴槽、およびワームをcorralling円でピペットのRNAi給餌ミックス。慎重に他の食事を乱すことなく、RNAiの給餌ミックスに戻って脱出を同軸ケーブルに転送ピペットを使用してください！ 給餌（〜1時間）した後、よく飼育プラナリアを識別する。これらのワームは、摂取した赤血球から深い赤の着色を示す。他人を捨てる。 慎重に、新鮮な湧き水を使用してソリューションを供給する食品の排せつ物を防ぐために、妨害を最小限に置き換えます。これを行うには、静かに濁った水を注ぐ、転送ピペットを用いてチューブの片側にワームをローカライズし、慎重に新鮮な水で置き換えるには、浴槽の反対側の壁を注いだ。再び潜水するのプラナリアは、すぐに空気に長時間さらされるとしても、食品の排せつ物をもたらす。 疎SEらの容器のふたやインキュベーターに復帰（24 ° C） 再生サイクル[プロトコル＃1]のRNAi表現型をスクリーニングするためのを織り交ぜ、複数のサイクルにわたるRNAiの給餌プロトコル（離れて2〜3日間）、繰り返します。多くの遺伝子のための効果的な給餌と再生のための標準プロトコルは、継続時間の合計で1ヶ月〜かかる図2に示されています。 最適なプロトコルはこのようなmRNAの安定性、組織局在性、タンパク質のperdurance、または再生後に複数の給餌サイクルを排除する表現型の開発などの要因に左右されるように、異なる遺伝子のためにこのスキームを変更します。単にネガティブコントロールのコホートで標的mRNAレベルを比較する表現型の浸透率（見かけの場合）のため、または定量PCR手法でスクリーニングすることによって、ノックダウンのレベルを評価する。 4。代表的な結果： トランクのフラグメントの再生アッセイでは、すべてのワームは、通常の前後（"尾に頭'）極性で再生成する必要がありますように堅牢です。これは、前eyespotsの出現（asterixed、 図1A）により促進、カットした後五日するとすぐに得点することができます。しかし、失われた構造物の完全な形態学的な復元は一週間後に発生します。双頭のワームを得るためにPZQによるトランクの断片の再生の薬理学的操作（ 図1B）も堅牢である（EC 50 = 87（+ – ）11％バイポーラフラグメント、48時間2070μMPZQ）。二極化は、単一の再生サイクルを介して行われます。これらのアッセイの下の有効性は、おそらく薬の溶解性および/またはストレージに関する問題、またはPZQは効果がない別の扁形動物の種の使用にも関する。低浸透率を有する薬剤の場合は、anteriorizationのインデックスは、多くの場合、完全な二極22から脇の中間表現型を獲得するために使用されます。正の制御構文のRNAi実験に起因する表現型を図1に示されています： ニホンDugesiaのRNAi 六1（D J六- 1）目のない表現型23（ 図1C）、Dugesia ジャポニカPC2のRNAi（DJ – PC2）の結果光嫌悪反応24（ 図1D）とのRNAiの損失の結果Dugesiaスギβcatenin- 1（DJ -βcatenin- 1）トランクのフラグメント（ 図1E）から双頭の表現型16-19、21の結果。これらの表現型は、次のような単純なRNAiのプロトコルを使用して達成することができます：DJ -六1（FFxFx）、DJ – PC2（FFFx）、DJ -βcatenin- 1（FFxFx）、ここで、F =給餌サイクルとx =再生サイクルそれぞれ。 図1：トランクのフラグメントの再生アッセイ左 、プラナリアの画像（上）と回路図（中央）切り出したトランクのフラグメントの位置を示すために右 、指示された時間（日数）で再生フラグメントの外観を示すトランクのフラグメントの再生のtimecourse B。。。 PZQの曝露によって生成される。双頭のプラナリアの画像DJ -六1のRNAi。モバイルコントロールのワームに比べて不動のDJ – PC2のRNAiワーム（ステンドグラス赤）の光嫌悪反応のDの損失、（ステンドによって生成されたC'目のない"ワーム緑）。Eバイポーラプラナリアは、DJ -βcatenin- 1 RNAiにより作り出した。 BEで、RNAiはワームのオリジナルの前端には、左に指向です。 図2：D.における多くの遺伝子のノックダウンに有効である、複数の栄養（F）、及び再生サイクルを構成する典型的なRNAiのプロトコル（x）の供給と切断サイクルのシーケンスジャポニカ 。個々の遺伝子のためのこのプロトコルの変更が少ない（括弧）や給餌と再生のサイクルのより大きい数を使用する例については、最適な結果を得ることが必要になることがあります。