Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

1. Trunk-Fragment Regeneration Test Stop-Fütterung einer Kohorte von Würmern für mindestens 5 Tage vor der regenerativen Test, um sicherzustellen, Tiere sind frei von Abfall und aufgenommene Nahrung (~ 30 intakt Würmer, jeder Wurm ~ 8-10 mm langen post-Hunger). Am Tag des Tests, spülen Sie eine pre-frozen eingeebnet Eis Schüssel mit Wasser und deckt den flachen vereisten Oberfläche mit Klarsichtfolie auslegen. Mit einer Pinzette, stellen Sie einen Filterpapier auf der Plastikfolie. Feuchten Sie das Filterpapier mit ein paar Tropfen Quellwasser. Transfer Planarien auf Filterpapier (<20 Würmern pro Filter) mit einem Transferpipette. Worms finden Sie auf Filter neu positioniert werden, falls notwendig, durch repipetting mit mehr Quellwasser. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit. Mit einem Skalpell amputieren den Kopf durch einen einzigen Schnitt etwa auf halbem Weg zwischen der vorderen Spitze des Tieres und dem vorderen Ende des Pharynx (Abbildung 1A) hergestellt. Mit einem Skalpell amputieren Heckbereich durch einen einzigen Schnitt gemacht etwa auf halbem Weg zwischen dem hinteren Ende des Tier-und hinteren Ende des Pharynx (Abb. 1A). Entfernen Sie überschüssigen Schleim auf das Skalpell mit einem Papiertuch, befeuchtet mit 70% Ethanol nach dem Schneiden. Überschüssiges Ethanol aus Skalpell. Transfer-Filter über Pinzette in eine Petrischale (100 x 25mm Tiefe) mit Quellwasser. Warten Sie ca. 3 Minuten (für den Wundverschluss, beobachtbaren durch einen Quetsch-und Verdunkelung der Wunde). Spülen Stamm-Fragmente aus Filterpapier in Petrischale mit gewünschte Medium für regenerative Assay und Transfer zum thermostatisierten Inkubator (24 ° C). Ergebnis regenerative Phänotyp nach ~ 1 Woche, wenn regeneriert Strukturen erkennbar (Abb. 1A). 2. Pharmakologische Manipulation der Regeneration: Bipolarität von Praziquantel induzierten Bereiten Sie Praziquantel (PZQ) Lager durch Lösen Medikament in DMSO (62.4mg PZQ in 1ml für 200mm Lager). Verwenden Sie am selben Tag. Machen Sie 50 mL der Drogen-haltige Lösung (90 uM PZQ) in gepufferter Montjuch Salze. Vortex für ~ 1 Minute, um die Dispersion zu gewährleisten. Führen Stamm-Fragment regenerative Assay wie oben beschrieben [Protokoll Nr. 1], Aussetzen einer Kohorte von Stamm-Fragmente PZQ im letzten Schritt [1,7]. Nach 24-48 Stunden, Austausch PZQ-haltigen Medien für Quellwasser, Wasch-Würmer mehrere (> 3) mal. Zurück Würmer Inkubator. Ergebnis Bipolarität (zwei Köpfe, Abbildung 1B) 1 Woche nach dem Schneiden. 3. Genetische Manipulation der Regeneration: in vivo RNAi Fütterung Protokoll Vor dem Test vorbereiten Hühnerleber Homogenat. Discard Fettsäuren, gelb gefärbte Abschnitte aus Lebensmittelvorräten und Püree verbleibenden Leber. Filter Püree durch Mesh-Sieb und aliquoten Aufhängung für die Lagerung (1.5 mL Röhrchen, -20 ° C). Vor dem Test vorbereiten Rinder roten Blutkörperchen (Erythrozyten) durch Aliquotierung Versorgung in 1ml Proben bei -20 ° C. Wählen Würmer für RNAi. Drei Kohorten werden: Gen von Interesse, positive Kontrolle (Gen mit bekannten RNAi-Phänotyp; Abbildung 1C, D & E) und eine negative Kontrolle (Gen ohne RNAi-Phänotyp, auch nützlich für die Beurteilung der Knockdown Ebenen im Vergleich zu experimentellen Kohorte). Für jede Kohorte, verwenden Sie ~ 250 Würmer (~ 8-10 mm lange, nachdem hungern für mindestens 5 Tage). Shop in Quellwasser in Plastikwanne. Für jede RNAi Kohorte Tauwetter Lager von E. coli exprimieren dsRNA Targeting Gen von Interesse [8], zusammen mit einem Rohr aus Hühnerleber Homogenat [3.1] und einem Rohr von RBC [3,2]. Pellet Bakterien (13.000 g, 1 Minute). Überstand entfernen und Pellet in 2xYT Medien (~ 700μl). Zentrifugieren, Überstand verwerfen, Pellet-Platz auf dem Eis. Erstellen Sie eine große Bohrung P200 Pipettenspitze durch das Abschneiden der Ende der Spitze. Gründlich resuspendieren Bakterienpellet in einer Mischung aus Geflügelleber Homogenat (150 mL) und Erythrozyten (50 ul), um RNAi Fütterung Remix erstellt werden. Luftblasen durch Zentrifugation. Für die Fütterung, entfernen Sie den größten Teil des Wassers aus der Kunststoffwanne mit Würmern (leave ~ 1 Zoll Tiefe). Swirl Wanne Würmer in der Mitte der Verpackung konzentrieren und Pipette RNAi Fütterung Mischung in einen Kreis einzupferchen Würmer. Verwenden Sie einen Transferpipette sorgfältig Koax-Flüchtlinge zurück auf die RNAi Fütterung Mix ohne störende anderen Gäste! Nach der Fütterung (~ 1 Stunde), zu identifizieren Planarien, die gut genährt. Diese Würmer zeigen eine tiefrote Färbung von eingenommenen RBC. Discard andere. Vorsichtig wieder Nährlösung mit frischem Quellwasser und minimiert Störungen Egestion von Lebensmitteln zu verhindern. Um dies zu tun, sanft lokalisieren die Würmer auf der einen Seite der Röhre mit einem Transferpipette, gieße trübem Wasser und sorgfältig mit frischem Wasser zu ersetzen ergossen sich die gegenüberliegende Wand der Wanne. Resubmerge Planarien schnell wie bei längerer Exposition an der Luft führt auch in Lebensmitteln Egestion. Locker seal Behälterdeckel und Rückkehr zum Inkubator (24 ° C) Wiederholen Sie die RNAi Fütterung Protokoll über mehrere Zyklen (~ 2-3 Tage auseinander), mit regenerativen Zyklen [Protokoll Nr. 1], um Bildschirm für RNAi-Phänotypen durchsetzt. Ein Standardprotokoll für die Fütterung und die Regeneration effektiv für viele Gene ist in Abbildung 2, die ca. 1 Monat dauert in Gesamtdauer angezeigt. Ändern Sie diese Regelung für verschiedene Gene, wie eine optimale Protokoll auf Faktoren wie die Stabilität der mRNA-, Gewebe-Lokalisierungs-, Protein-perdurance oder die Entwicklung von einem Phänotyp, der mehrere Werkstücksumspannzyklen schließt nach der Regeneration abhängen wird. Beurteilen knockdown Ebenen durch einfaches Screening nach Penetranz des Phänotyps (wenn erkennbar), oder durch qPCR Ansätze zur gezielten mRNA-Spiegel mit negativen Kontrolle Kohorte zu vergleichen. 4. Repräsentative Ergebnisse: Der Stamm-Fragment Regeneration Test ist robust, so dass alle Würmer sollten mit normaler anterior-posterior ("Kopf-Schwanz") Polarität zu regenerieren. Dies kann, sobald 5 Tage nach dem Schneiden, durch das Aufkommen des vorderen Augenflecken (asterixed, Abbildung 1A) erleichtert gewertet. Allerdings tritt vollständige morphologische Wiederherstellung der verlorenen Strukturen nach einer Woche. Pharmakologische Manipulation von Stamm-Fragment Regeneration durch PZQ zu zweiköpfigen Würmer Ausbeute (Abbildung 1B) ist auch robust (EC 50 = 87 (+ -) 11% bipolare Fragmente, 70μM PZQ für 48 Stunden 20). Bipolarität erfolgt über eine einzige regenerative Zyklus. Geringere Wirksamkeit bei diesen Tests wahrscheinlich bezieht sich auf Probleme mit Drogen Löslichkeit und / oder Lagerung oder Verwendung eines anderen flatworm Arten, bei denen PZQ ist unwirksam. Bei Medikamenten mit geringer Penetranz, ist eine Vorverlegung Index häufig verwendet, um Zwischen-Phänotypen beiseite Ergebnis aus kompletten Bipolarität 22. Phänotypen, die sich aus RNAi der positiven Kontrolle Konstrukte sind in Abbildung 1 dargestellt: RNAi von Dugesia japonica sechs 1 (D j-six-1) führt zu einer eyeless Phänotyp 23 (1C), RNAi von Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) führt zu einem Verlust des Lichtes Abneigung Antwort 24 (1D) und RNAi von Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) führt zu einer zweiköpfigen Phänotyp 16-19, 21 aus Stamm-Fragmente (Abb. 1E). Diese Phänotypen lassen sich mit den folgenden einfachen RNAi Protokolle werden: Dj-six-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), wo F = Fütterung Zyklus und x = regenerative Zyklus jeweils. Abbildung 1:… Trunk Fragment Regeneration Assay A Left, Image der Planarie (oben) und schematische (Mitte) auf Position herausgeschnitten Stamm-Fragment zeigen Right, zeigt Zeitverlauf der Stamm-Fragment Regeneration Aussehen zu regenerieren Fragment bei angegebenen Zeiten (Tage) B Image of zweiköpfigen Planarie durch PZQ Belichtung hergestellt. C 'Eyeless "Wurm von Dj-six-1 RNAi. D Lichtverlust Abneigung Reaktion in immobile Dj-PC2 RNAi Würmer (rot gefärbt), im Vergleich zu mobilen Kontrolle Wurm (gebeizt hergestellt grün). E Bipolar Planarie von Dj-βcatenin-1 RNAi produziert. In BE, ist die ursprüngliche vordere Ende des RNAi Würmer orientiert sich an der linken Seite. Abbildung 2: Ablauf der Fütterung und Schneiden Zyklen für typische RNAi-Protokoll aus mehreren Fütterungen (F), und der regenerativen Zyklen (x), die effektiv für Knockdown von vielen Genen in D. ist japonica. Änderung dieses Protokolls für einzelne Gene erforderlich sein, um optimale Ergebnisse zu erzielen, zum Beispiel mit einem weniger (Klammern) oder eine größere Anzahl von Fütterung und regenerative Zyklen.