في الوقت الحقيقي المعاوقة الكهربائية تقنية تستند إلى قياس غزو أحادي الطبقة الخلية البطانية من قبل خلايا السرطان
Summary
توضح هذه المقالة<em> في المختبر</em> تقنية لرصد الخلايا السرطانية الغازية من خلال أحادي الطبقة من الخلايا البطانية. ويتم الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي بوصفها وظيفة من التغييرات في مقاومة على السطح من الأقطاب الكهربائية في أسفل جيدا.
Abstract
نشر المنتشر من الخلايا الخبيثة يتطلب تدهور الغشاء القاعدي، المرفقات من خلايا الورم لبطانة الأوعية الدموية، تراجع من التقاطعات البطانية وأخيرا الغزو والهجرة من الخلايا السرطانية من خلال طبقة البطانية لدخول مجرى الدم كوسيلة من وسائل النقل إلى مواقع بعيدة في البلد المضيف 1-3. مرة واحدة في نظام الدورة الدموية، وسرطان الخلايا الشعرية التمسك الجدران ويتسرب إلى الأنسجة المحيطة بها لتشكيل أورام النقيلي 4،5. يمكن تكرارها مختلف مكونات الورم التفاعل خلية خلية البطاني في المختبر من خلال تحدي أحادي الطبقة من الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVEC) مع الخلايا السرطانية. وتشير الدراسات التي أجريت مع الإلكترون المجهري وعلى النقيض من المرحلة أن في تسلسل المختبر من الأحداث تمثل إلى حد ما في الجسم الحي عملية النقيلي 6. هنا، نحن تصف تقنية الكهربائية مقاومة على أساس ان ترصد والكمي في الوقت الحقيقي invasأيون الخلايا البطانية من قبل خلايا الورم الخبيث.
Giaever وفندق Keese وصف لأول مرة تقنية لقياس التقلبات في مقاومة عندما ينمو عدد السكان من الخلايا على سطح الأقطاب 7،8. الصك xCELLigence، المصنعة من قبل شركة روش، ويستخدم تقنية مماثلة لقياس التغيرات في مقاومة الكهربائية والخلايا نعلق وتنتشر في طبق الثقافة مغطاة مجموعة مسرى مكروي الذهب الذي يغطي حوالي 80٪ من المساحة في أسفل البئر. كما خلايا نعلق وتنتشر على سطح القطب، فإنه يؤدي إلى زيادة في مقاومة الكهربائية 9-12. يتم عرض مقاومة كمعلمة يسمى خلية مؤشر أبعاد، وهو يتناسب طرديا مع مساحة إجمالية قدرها الأنسجة الثقافة جيدا أن تغطيها الخلايا. وبالتالي، فإن مؤشر الخلية يمكن أن تستخدم لرصد التصاق الخلية، ونشر، مورفولوجيا وكثافة الخلايا.
ويستند مقايسة غزو الموضحة في هذه المقالة على التغييراتفي مقاومة الكهربائية في القطب / الخلية الطور البيني، كما يبلغ عدد سكانها غزو الخلايا الخبيثة من خلال HUVEC أحادي الطبقة (الشكل 1). تعطيل تقاطعات البطانية، تراجع من أحادي الطبقة البطانية واستبدال من قبل الخلايا السرطانية يؤدي إلى تغيرات كبيرة في مقاومة. هذه التغييرات ترتبط مباشرة مع القدرة الغازية من الخلايا السرطانية، أي غزو من قبل خلايا شديدة العدوانية تؤدي إلى تغييرات كبيرة في مقاومة الخلية والعكس بالعكس. توفر هذه التقنية ميزة اثنين أضعاف خلال الأساليب القائمة لقياس الغزو، مثل غرفة بويدن والمقايسات matrigel: 1) البطانية التفاعل خلية خلية للورم يحاكي بشكل وثيق في عملية الجسم الحي، و 2) يتم الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي، الوقت وأكثر قابلة للقياس بسهولة، خلافا لتحليل نقطة النهاية بالنسبة لطرق أخرى.
Protocol
Discussion
في الوقت الحقيقي HUVEC مقايسة الغزو هو طريقة بسيطة، لكنها قوية لغزو الرصد. أنها توفر النتائج في الوقت الحقيقي، والذي هو تفوقا كبيرا على التقنيات التقليدية الأخرى التي تعتمد على تحليل نقطة النهاية. الفحص يمكن تعديلها لاختبار المخدرات، والأجسام المضادة، والبروتينات يغاندس باسم مثبطات أو التحفيز والتشجيع من ورم خبيث. تأثير عوامل مختلفة على البطانية / سرطان الخلية عبر الحديث يمكن تقييمها كذلك. عند إدخال عوامل خارجية، مثل عوامل النمو والمخدرات في وسائل الإعلام والثقافة، فمن المهم للتأكد من أنها لا تؤثر على سلامة أحادي الطبقة HUVEC. اضطراب أحادي الطبقة HUVEC يمكن اختبارها من خلال إدخال وكيل الخارجية في غياب غزو الخلايا، وضمان أنه لا يوجد أي تغيير في مؤشر الخلية. وبالتالي، ينبغي أن تدرج الضوابط المناسبة كجزء من التصميم التجريبي.
خطوط مختلفة من الخلايا تظهر منحنيات مختلفة الخلية مؤشر لأنها تشكل أسيوطأحادي الطبقة luent. شكل منحنى، وكذلك الحد الأقصى خلية مؤشر تحقيقه، هو من نوع خلية معينة. الخلايا HUVEC تظهر عابرة مميزة تسطيح مؤشر الخلية بعد 4-6 ساعات البذر، تليها استقرار آخر في مؤشر الخلية أعلى بعد 16-18 ساعة. وبالتالي، فإنه من المهم للسماح للخلايا تشكيل أحادي الطبقة متموجة لمدة 18 ساعة على الأقل قبل إضافة الخلايا السرطانية.
منذ مؤشر الخلية يعتمد على البيئة الأيونية في القطب / الخلية الطور البيني، والعوامل المختلفة مثل خلية التشكل ونوعية التصاقات خلية خلية التأثير على مؤشر الخلية، بالإضافة إلى منطقة أسفل جيدا تغطيتها. وبالتالي، فإن الانخفاض في مؤشر الخلية، والذي يحدث عند غزو الخلايا السرطانية، هي وظيفة من عدة عوامل، والتي تشمل تراجع من التقاطعات البطانية وغزو الخلايا السرطانية لاحقة.
يتم تصنيعها الصك xCELLigence في ثلاثة أشكال مختلفة: ريال مدريد محلل خلية الوقت(RTCA) ليرة سورية، RTCA النائب RTCA وموانئ دبي. وRTCA SP صك يحمل واحدة 96-جيدا لوحة E حين أن الصك النائب RTCA يمكن أن تعقد ما يصل إلى ستة 96 جيدا لوحات E في وقت واحد. وهذا يسمح لفحص عالية الإنتاجية من الأدوية والمركبات. يتم تنفيذ التجارب في هذا المقال باستخدام أداة موانئ دبي RTCA، التي يمكن أن تعقد ثلاث 16 جيدا لوحات E. كل محطة عقد E-لوحة يمكن أن تعمل بشكل مستقل، والذي يسمح للمستخدمين متعددة لتشغيل التجارب في وقت واحد. ويمكن أيضا الصك موانئ دبي RTCA أن تستخدم لدراسة الهجرة باستخدام CIM لوحات. هذه هي لوحات 16 بشكل جيد مع الغرف العلوية والسفلية مفصولة البولي إثيلين (PET) الغشاء مع حجم المسام وسيطة من 8um. توجد أجهزة استشعار إلكترونية على الجانب السفلي للغشاء يسهل اختراقها للغرفة العليا. مجلس النواب بمثابة خزان للجاذب كيميائي للخلايا في مجلس الشيوخ. ومع ذلك، فإن الميزة الرئيسية للمقايسة غزو HUVEC خلال لوحات CIM هو أن غزو الخلايا السرطانية في السابق أناليست مقيدة حجم المسام، كما غزو الخلايا البطانية يعتمد على عبر الحديث بين الخلايا السرطانية والخلايا البطانية.
ويمكن أيضا فحص غزو HUVEC سيتم تنفيذه على صك Z ECIS، المصنعة من قبل الفيزياء الحيوية التطبيقية (تروي، نيويورك). الصك Z ECIS تستخدم تقنية مماثلة في الصك xCELLigence، مع وجود اختلافات في تكوينات مجموعة والقطب. لقد أجرينا بنجاح فحوصات غزو HUVEC باستخدام صفائف ECIS 8 جيد. ومن المهم أن نلاحظ أن مساحة السطح جيدا أسفل أكبر في صفائف ECIS، الأمر الذي يتطلب عددا أكبر من الخلايا البطانية والورم ليكون مطلي: 2.5 × 10 5 و 1 × 10 5 خلايا على التوالي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بسخاء من أموال من أطفال مؤسسة السرطان (بالتيمور، MD)، براندون لي كارينغتون مؤسسة (سيلفر سبرينغ، MD)، وزارة الدفاع (W81XWH-10-1-0137) والمعاهد الوطنية للصحة (R01CA108641).
ونود أن نشكر الدكتور انطون Wellstein وأعضاء مختبره لتبادل خبراتهم ومساعدتنا على تحسين الأساليب المعروضة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
