Un tempo reale impedenza elettrica tecnica basata su Misura Invasione di cellule endoteliali monostrato dalle cellule tumorali
Summary
Questo articolo descrive una<em> In vitro</em> Tecnica per le cellule tumorali che invadono monitoraggio mediante un monostrato di cellule endoteliali. I dati vengono acquisiti in tempo reale in funzione delle variazioni dell'impedenza sulla superficie degli elettrodi sul fondo del pozzo.
Abstract
Diffusione metastatica delle cellule maligne richiede degradazione della membrana basale, dell'adesione delle cellule tumorali all'endotelio vascolare, retrazione delle giunzioni endoteliali ed infine invasione e la migrazione delle cellule tumorali attraverso lo strato endoteliale per entrare nel flusso sanguigno come mezzo di trasporto in sedi lontane l'host 1-3. Una volta nel sistema circolatorio, le cellule tumorali aderiscono per capillarità pareti e stravaso al tessuto circostante per formare tumori metastatici 4,5. I vari componenti di interazione cellula-cellula endoteliale tumorale possono essere replicate in vitro sfidando un monostrato di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) con cellule tumorali. Studi eseguiti con elettroni e microscopia in contrasto di fase suggeriscono che la sequenza in vitro di eventi rappresenta in maniera corretta il processo metastatico in vivo 6. Qui, descriviamo una tecnica basata elettrico-impedenza che controlla e quantifica in tempo reale le Invasione delle cellule endoteliali mediante cellule tumorali maligne.
Giaever e Keese prima descritto una tecnica per misurare fluttuazioni di impedenza quando una popolazione di cellule crescono sulla superficie degli elettrodi 7,8. Lo strumento xCELLigence, prodotto da Roche, utilizza una tecnica simile a misurare le variazioni di impedenza elettrica come cellule attaccano e dispersi in un piatto di coltura coperto con una matrice microelettrodo oro che copre circa l'80% della zona sul fondo di un pozzo. Come cellule aderiscono e diffondono sulla superficie dell'elettrodo, porta ad un aumento di impedenza elettrica 9-12. L'impedenza viene visualizzata come parametro adimensionale definito cell-index, che è direttamente proporzionale alla superficie totale del tessuto-coltura bene che è coperto da cellule. Quindi, la cellula-indice può essere utilizzato per monitorare l'adesione cellulare, diffusione, morfologia e densità cellulare.
Il saggio di invasione descritto in questo articolo si basa su cambiamentiin impedenza elettrica all'elettrodo / cellula interfase, come una popolazione di cellule maligne invadono attraverso un monostrato HUVEC (Figura 1). La distruzione delle giunzioni endoteliali, retrazione del monostrato endoteliale e la sostituzione da parte delle cellule tumorali portare a grandi cambiamenti di impedenza. Questi cambiamenti correlano direttamente con la capacità invasiva delle cellule tumorali, cioè, invasione di cellule altamente aggressivi portare a grandi cambiamenti di impedenza della cella e viceversa. Questa tecnica fornisce un duplice vantaggio rispetto ai metodi esistenti di misurazione invasione, come camera di Boyden e dosaggi Matrigel: 1) l'interazione cellula-tumorale delle cellule endoteliali imita più da vicino il processo in vivo, e 2) i dati sono ottenuti in real- tempo ed è più facilmente quantificabile, al contrario di analisi end-point per altri metodi.
Protocol
Discussion
Il tempo reale saggio di invasione HUVEC è un metodo semplice, ma potente per il monitoraggio invasione. Esso fornisce risultati in tempo reale, che è un vantaggio significativo rispetto ad altre tecniche tradizionali che si basano su analisi end-point. Il dosaggio può essere modificato per testare farmaci, anticorpi, ligandi e proteine come inibitori o stimolatori di metastasi. L'effetto di agenti diversi su endoteliale / carcinoma diafonia può essere valutata come bene. Nell'introdurre agenti esogeni, quali fattori di crescita e medicinali nei terreni di coltura, è importante garantire che non influenzano l'integrità del monostrato HUVEC. Perturbazione del monostrato HUVEC può essere testato introducendo l'agente esogeno in assenza di invadere le cellule, e garantendo che non vi è alcun cambiamento di indice cella. Così, gli opportuni controlli dovrebbero essere inclusi come parte del disegno sperimentale.
Diverse linee cellulari differenti curve dimostrano cell-index quanto formano un confmonostrato luent. La forma della curva, così come il massimo cellula-index raggiunto, è tipo cellulare specifico. Cellule HUVEC mostrano una caratteristica transitoria appiattimento indice cella 4-6 ore dopo la semina, seguito da un altro stabilizzazione ad un indice cella superiore dopo 16-18 ore. Quindi, è importante permettere alle cellule formano un monostrato confluente per almeno 18 ore prima dell'aggiunta di cellule tumorali.
Poiché l'indice cella dipende l'ambiente ionico in corrispondenza dell'elettrodo / cellula interfase, vari fattori come cellula-morfologia e qualità delle adesioni cellula-cellula influenzano la cellula-index, oltre alla zona del fondo ben coperto. Così, la diminuzione dell'indice cella, che si verifica su di invasione delle cellule tumorali, è funzione di diversi fattori, che includono la retrazione delle giunzioni endoteliali e successiva invasione delle cellule tumorali.
Lo strumento xCELLigence è prodotto in tre diverse configurazioni: analizzatore cellula tempo reale(RTCA) SP, RTCA MP e RTCA DP. Lo strumento RTCA SP detiene un 96-ben E-piastra che lo strumento RTCA MP può contenere fino a sei a 96 pozzetti e-piastre contemporaneamente. Questo permette di high-throughput screening di farmaci e composti. Gli esperimenti in questo articolo sono eseguite utilizzando lo strumento RTCA DP, che può contenere tre a 16 e E-piastre. Ogni stazione di partecipazione E-piastra può essere utilizzato in modo indipendente, che consente a più utenti di eseguire esperimenti contemporaneamente. Lo strumento RTCA DP può essere utilizzato anche per studiare la migrazione utilizzando CIM-piastre. Queste sono le piastre a 16 pozzetti con camere superiori e inferiori separati da un polietilene tereftalato (PET) membrana con dimensione dei pori media di 8um. I sensori elettronici sono situati sul lato inferiore della membrana porosa della camera superiore. La camera inferiore funge da serbatoio per chemiotattico per cellule nella camera superiore. Tuttavia, uno dei principali vantaggi del saggio di invasione HUVEC negli CIM-piastre è che l'invasione delle cellule tumorali nel primo is non è limitata dalla dimensione dei pori, l'invasione delle cellule endoteliali dipende diafonia tra le cellule tumorali ed endoteliali.
Il saggio di invasione HUVEC può anche essere eseguita su strumento ECIS Z, prodotto da Applied Biophysics (Troy, NY). Lo strumento ECIS Z utilizza una tecnologia simile allo strumento xCELLigence, con differenze nelle configurazioni di array elettrodo. Abbiamo effettuato con successo i test di invasione HUVEC utilizzando gli array ECIS 8 pozzetti. È importante notare che la superficie di fondo è ben maggiore nelle matrici ECIS, che richiede un numero maggiore di cellule endoteliali e tumorali di essere placcato: 2,5 x 10 5 e 1 x 10 5 cellule rispettivamente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato generosamente sostenuto da fondi provenienti da bambini Cancer Foundation (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) e NIH (R01CA108641).
Vorremmo ringraziare il Dott. Anton Wellstein e membri del suo laboratorio per condividere la loro esperienza e ci aiuta ad ottimizzare i metodi presentati.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
