טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

1. הכנה יש לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים במכסת מנוע בתרבית רקמה. תחנת xCELLigence ממוקמת 37 מעלות צלזיוס חממה בנוכחות של 5% CO 2. השתמש בתאי HUVEC מעבר נמוכים, רצוי לא יותר מ 6 מעבר. כמו כן, ודא כי התאים הם לא יותר מ 75% ומחוברות בזמן קציר. תאי HUVEC גדלים בתקשורת EGM-2 מחדש עם ערכת EGM-2 כדור (Lonza Biosciences) המכילה גורמי גדילה, תוספי מזון ו5% בסרום שור העובר. כל העקבות של טריפסין יש להסיר מהשעיות תא על ידי תאים מסתובבים ב200xg, שטיפת פעם עם PBS, וresuspending לצפיפות תאים מצוינים. xCELLigence מעיל E-צלחת 16 עם 0.1% ג'לטין במשך שעה 1 ב 37 ° C או הלילה ב 4 ° C. לשטוף צלחת עם PBS ולהוסיף EGM-2 המשוחזרת 100μL תקשורת. לבצע קריאה ריקה במערכת xCELLigence למדוד רקעעכבה בהעדר תאים. 2. יצירת HUVEC monolayer קציר בקבוק תת ומחוברות של תאי HUVEC ידי trypsinization. תאי Resuspend בEGM-2 מדיה המשוחזרת לצפיפות סופית של 2.5 x 10 5 תאים / מ"ל. היטב בכל רקע מכויל דואר צלחת המכיל EGM-2 מדיה 100μL, להוסיף 100μL של ההשעיה תא HUVEC (2.5 10 4 תאי HUVEC X). מייד להתקין דואר פלייט במכשיר xCELLigence. תוכנת xCELLigence תכנית לבצע קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות. תן לתאי אנדותל לגדול במשך 18-21 שעות עד שהם יוצרים monolayer, כפי שמעיד על ידי השטחה של מדד תא (איור 2). 3. תוספת של פולשים לתאים ונורמליזצית נתונים. ברגע שmonolayer HUVEC יציב יצרה, תאים סרטניים על ידי קציר trypsinization וresuspend למאורות סופייםity של 1 x 10 5 תאים / מ"ל בתקשורת משמשת לגידול תאים סרטניים (כמו RPMI או מדיה DMEM המכיל 10% FBS) קריאות עכבת הפסקה על תוכנת xCELLigence ולהסיר דואר פלייט מהתחנה. הסר תקשורת EGM-2 על ידי שאיפה. הוסף 100μL של השעיה תא גידול המכילה 1 x 10 4 תאים. באופן כללי, יחס 1:2.5 של תאים סרטניים: בתאי אנדותל זורעים, עובד הכי טוב עבור assay. עם זאת, היחס יכול להיות מותאם לשורות תאים בודדות. הנח את דואר הצלחת על מערכת xCELLigence בחממה ולהמשיך קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות. פלישה יכולה להיות במעקב בזמן אמת על 6-12 שעות הקרובות כמו ירידה במדד תא בשל הנסיגה של הצמתים אנדותל וחדיר של פולשים לתאים סרטניים. לנרמל את התוצאות לזמן של תוספת של פולשים לתאים סרטניים. התוכנה מאפשרת xCELLigence נורמליזציה לכל נקודת זמן ותוצאותניתן לצפות ישירות בחלון התוכנה. 4. נציג תוצאות: דוגמה לפלישת monolayer HUVEC ידי תאים גרורתי ולא גרורתי מוצגת באיור 3. K7M2 הוא שורת תאי אוסטאוסרקומה גרורתי. תאים אלה מבטאים רמות גבוהות של חלבון ezrin מקשר cytoskeletal, המהווה את המאפיינים פולשני של קו תא זה 13,14. כאשר תאי HUVEC מאותגרים עם K7M2 תאים, יש ירידה בהתנגדות חשמלית בתוך 6 שעות. ירידה זו בהתנגדות חשמלית מייצגת את הפלישה לmonolayer HUVEC על ידי תאי הגידול הפולשים. תא אונליין K12, לעומת זאת, מבטא רמות נמוכות יותר של ezrin וכתוצאה מכך היא פחות גרורתי 13. מאתגר את monolayer HUVEC עם תוצאות K12 תאים בירידה תלולה פחות בהתנגדות כמו התאים אינם מסוגלים לדבוק או לפלוש דרך monolayer HUVEC (איור 3). <imgsrc = גובה "/ files/ftp_upload/2792/2792fig1.jpg" = "איור 1" /> איור 1. תרשים סכמטי של תהליך זרימת עבודה לפלישה של תאי האנדותל ידי תאי גידול. תאי HUVEC הם מצופים ב E-צלחות מצופים ג'לטין ואפשרו ליצירת monolayer מחוברות. תאים ממאירים מתווספים פעם monolayer יצרה ופלישה מנוטרת בזמן אמת כמדד התא משתנה עקב פלישה של monolayer אנדותל. איור 2. היווצרות monolayer HUVEC. שינויים במדד תא כתאי HUVEC לצרף ולהתפשט על אלקטרודות זהב ג'לטין מצופות. היווצרות monolayer ומחוברת מיוצגת על ידי התייצבות במדד תא לאחר 18 שעות. איור 3. פלישה של תאי HUVEC ידי K7M2 וK12 תאי אוסטאוסרקומה. ירידה חדה בcelL-מדד מתרחש בתוך כמה שעות של ההקדמה של K7M2 תאים גרורתי מאוד. K12 תאים, לעומת זאת, הם פחות גרורתי ולא מצליחין לחדור monolayer האנדותל בצורה יעילה ככל K7M2 תאים. זה מיוצג על ידי ירידה פחות חדה במדד תא כאשר monolayer HUVEC הוא קרא תיגר עם K12 תאים. שליטה מייצגת עכבה של monolayer HUVEC בהיעדרם של תאים סרטניים. ניסויים בוצעו בשלושה עותקים.