A técnica de impedância elétrica em tempo real baseado medir Invasão de monocamada de células endoteliais por células cancerosas
Summary
Este artigo descreve uma<em> In vitro</em> Técnica para células cancerosas invasoras de monitorização por meio de uma monocamada de células endoteliais. Os dados são adquiridos em tempo real, como uma função de alterações na impedância sobre a superfície de eléctrodos no fundo bem.
Abstract
Disseminação metastática de células malignas requer degradação da membrana basal, a ligação de células de tumor ao endotélio vascular, a retracção das junções endoteliais e, finalmente, a invasão e a migração de células tumorais através da camada endotelial para entrar na corrente sanguínea, como meio de transporte para locais distantes do hospedeiro 1-3. Uma vez que no sistema circulatório, as células cancerígenas aderem à parede capilar e extravasar para o tecido circundante de modo a formar tumores metastáticos 4,5. Os vários componentes de interacção célula-célula endotelial tumoral pode ser replicado in vitro por desafio de uma monocamada de células endoteliais humanas da veia umbilical (HUVEC) com as células cancerosas. Estudos realizados com elétrons e microscopia de contraste de fase sugerem que a seqüência em vitro de eventos representam adequadamente o processo metastático in vivo 6. Aqui, descrevemos uma técnica baseada em impedância elétrica que monitora e quantifica em tempo real, as invasião de células endoteliais de células tumorais malignas.
Giaever Keese e descrita pela primeira vez uma técnica para medir as flutuações na impedância quando uma população de células crescem sobre a superfície dos eléctrodos 7,8. O instrumento xCELLigence, fabricado pela Roche, utiliza uma técnica semelhante para medir as variações na impedância eléctrica como células de prender e espalhado num prato de cultura coberta com uma matriz de microeléctrodos de ouro que cobre cerca de 80% da superfície da parte inferior do poço. Como as células anexar e espalhada sobre a superfície do eléctrodo, ele conduz a um aumento na impedância eléctrica 9-12. A impedância é apresentada como um parâmetro sem dimensões denominado índice de células, que é directamente proporcional à área total do poço de cultura de tecidos, que é coberto por células. Assim, o índice de célula pode ser usado para monitorar a adesão celular, espalhamento, a morfologia e a densidade de células.
O ensaio de invasão descrito neste artigo é baseado em mudançasna impedância eléctrica no eléctrodo / células de interfase, como uma população de células malignas invadem através de uma monocamada de HUVEC (Figura 1). A ruptura das junções endoteliais, retracção da monocamada de células endoteliais e sua substituição por células tumorais levar a grandes alterações na impedância. Estas alterações directamente correlacionadas com a capacidade invasiva de células tumorais, isto é, a invasão por células altamente agressivos levar a grandes alterações na impedância de células e vice-versa. Esta técnica proporciona uma dupla vantagem em relação aos métodos existentes de medição, tais como invasão câmara de Boyden e ensaios matrigel: 1) a interacção célula-célula endotelial tumoral imita mais de perto o processo in vivo, e 2) os dados são obtidos em tempo real, tempo e é mais facilmente quantificáveis, em oposição a análise de ponto final para outros métodos.
Protocol
Discussion
O ensaio de invasão HUVEC em tempo real é um método simples, mas poderosa para a invasão de monitoramento. Ele fornece resultados em tempo real, o que é uma vantagem significativa em relação a outras técnicas tradicionais, que se baseiam na análise de ponto final. O ensaio pode ser modificado para testar drogas, anticorpos, ligandos e proteínas como inibidores ou estimuladores da metástase. O efeito de diferentes agentes na endotelial / célula cancerosa conversa cruzada pode ser avaliada, bem. Quando a introdução de agentes exógenos, tais como factores de crescimento e os medicamentos nos meios de cultura, é importante para garantir que eles não afectam a integridade da monocamada de HUVEC. Perturbação da monocamada HUVEC pode ser testada através da introdução do agente exógeno na ausência de células invasoras, e garantir que não existe qualquer alteração no índice de células. Assim, os controles apropriados devem ser incluídos como parte do projeto experimental.
Linhas celulares diferentes demonstrar diferentes curvas de índice de células, que formam um confmonocamada luent. A forma da curva, bem como o valor máximo do índice da célula atingida, é do tipo de célula específico. Células HUVEC mostram uma característica transitória achatamento do índice de célula de 4-6 horas após a semeadura, seguido por outro de estabilização em um índice maior de células após 16-18 horas. Por isso, é importante para permitir que as células formam uma monocamada confluente durante pelo menos 18 horas antes da adição de células tumorais.
Uma vez que o índice de células está dependente do ambiente iónico no eléctrodo / células de interfase, por vários factores tais como a morfologia celular e qualidade de adesões célula-célula influenciar o índice de células, para além da área do poço inferior coberta. Assim, a diminuição no índice de célula, que ocorre após a invasão de células de tumor, é uma função de diversos factores, que incluem a retracção das junções endoteliais e invasão de células de tumor subsequente.
O instrumento xCELLigence é fabricado em três diferentes configurações: analisador de células em tempo real(RTCA) SP, RTCA MP e RTCA DP. O instrumento RTCA SP detém uma de 96 poços E-plate Considerando que o instrumento RTCA MP pode conter até seis de 96 poços E-chapas simultaneamente. Isto permite o rastreio de alto rendimento de drogas e compostos. Os experimentos deste artigo são realizadas utilizando o instrumento DP RTCA, que pode realizar três de 16 poços E-placas. Cada estação de realização E-plate pode ser operado de forma independente, o que permite que múltiplos usuários para executar experiências em simultâneo. O instrumento RTCA DP pode também ser usado para estudar a migração usando CIM-chapas. Estes são pratos de 16 poços com câmaras superior e inferior separadas por um tereftalato de polietileno (PET) de membrana com um tamanho de poro médio do 8um. Os sensores electrónicos estão localizados no lado de baixo da membrana porosa da câmara superior. A câmara inferior serve como um reservatório para o quimioatraente para células na câmara superior. No entanto, uma das principais vantagens do ensaio de invasão HUVEC nas placas CIM é que a invasão de células tumorais na ex-inão é restringida pelo tamanho do poro, como a invasão de células endoteliais depende de conversa cruzada entre as células tumorais e endoteliais.
O ensaio de invasão de HUVEC também pode ser realizada em ECIS Z instrumento, fabricado por Biofísica Aplicada (Troy, NY). O Z instrumento ECIS utiliza uma tecnologia semelhante ao instrumento xCELLigence, com diferenças nas configurações da matriz e eletrodo. Temos realizado com sucesso testes de invasão HUVEC usando as matrizes ECIS oito poços. É importante notar que a área de superfície bem inferior é maior nas matrizes ECIS, o que requer um maior número de células endoteliais e de tumor seja banhado: 2,5 x 10 5 a 1 x 10 5 células, respectivamente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi generosamente apoiado por fundos da Fundação do Câncer Infantil (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) e NIH (R01CA108641).
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Anton Wellstein e membros de seu laboratório para compartilhar sua experiência e nos ajudando a otimizar métodos apresentados.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |
References
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