В режиме реального времени Электрические характеристики Сопротивление техника выполнения измерить Вторжение клеточный монослой эндотелиальных раковыми клетками
Summary
В этой статье описывается<em> В пробирке</em> Технике для контроля раковых клеток вторжение через монослой эндотелиальных клеток. Данные получают в режиме реального времени в зависимости от изменений импеданса на поверхности электродов на забое скважины.
Abstract
Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.
Protocol
Discussion
В режиме реального времени вторжения HUVEC анализ является простой, но мощный метод мониторинга вторжения. Он предоставляет результаты в реальном времени, что является существенным преимуществом по сравнению с другими традиционными методами, которые опираются на анализ конечных результатов. Анализ может быть модифицирован, чтобы тестируемые лекарства, антитела, лиганды и белков в качестве ингибиторов или стимуляторов метастазов. Влияние различных агентов на эндотелиальных / раковых клеток перекрестных помех может быть оценена также. При введении экзогенных агентов, таких как факторы роста и препаратов в культуральной среде, важно, чтобы гарантировать, что они не оказывают влияния на целостность монослоя HUVEC. Разрушение монослоя HUVEC может быть проверена путем введения экзогенных агентов в отсутствие вторжения в клетки, и обеспечение того, нет никаких изменений в клеточной индекса. Таким образом, соответствующие элементы управления, должны быть включены как часть эксперимента.
Различные клеточные линии демонстрируют различные клетки-индекс кривые как они образуют конфluent монослоя. Форма кривой, а также максимальное клеточного индекс достигнута, является типом клеток конкретными. HUVEC клетки показывают характеристика переходных уплощение индекс ячейки 4-6 часов после посева, а затем еще стабилизации на более высоком индексе клетки после 16-18 часов. Следовательно, крайне важно, чтобы клетки образуют монослой по крайней мере 18 часов перед добавлением клеток опухоли.
Поскольку индекс ячейки зависит от ионной среде на границе электрод / клетка интерфазы различных факторов, таких как клеточной морфологии и качество межклеточных спаек влияние на клетки-индекс, в дополнение к области хорошо дно покрыты. Таким образом, снижение в ячейке индекс, который происходит при инвазии опухоли клетки, является функцией нескольких факторов, которые включают в себя отвода эндотелиальных соединений и последующее вторжение опухолевых клеток.
XCELLigence инструмент изготовлен в трех различных конфигурациях: анализатор реального времени клетки(RTCA) SP, MP и RTCA RTCA DP. Прибор RTCA SP занимает одно 96-а E-пластины в то время как прибор RTCA MP может вместить до шести 96-а E-пластин одновременно. Это позволяет для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов и соединений. Эксперименты в этой статье, выполняются с помощью инструмента RTCA DP, которое можно провести три 16-а E-пластин. Каждая пластина E-Холдинг станция может самостоятельно работать, что позволяет многим пользователям запускать экспериментов одновременно. Прибор RTCA DP также может быть использован для изучения миграции с использованием CIM-пластин. Эти 16-луночных планшетах с верхней и нижней камеры, разделенные полиэтилентерефталата (ПЭТ) мембраны со средним размером пор 8um. Электронные датчики расположены на нижней пористой мембраны из верхней камеры. Нижняя камера служит в качестве резервуара для хемоаттрактантных для клеток в верхней камере. Тем не менее, одним из основных преимуществ HUVEC анализа вторжение на CIM пластины является то, что инвазии опухоли клетки в бывшем яы не ограничивается размером пор, как эндотелиальные инвазии клеток зависит от перекрестных помех между опухолью и эндотелиальных клетках.
HUVEC анализа вторжения может быть также выполнена на инструменте ЕСНГ Z, выпускаемых прикладной биофизики (Троя, штат Нью-Йорк). Прибор ЕСНГ Z использует технологию, подобную xCELLigence инструментом, с различиями в массиве и конфигурации электродов. Мы успешно выступили HUVEC анализов вторжения помощью 8-и массивы Восточной Европы и СНГ. Важно отметить, что хорошо нижней поверхности область больше, в ЕСНГ массивы, который требует большего числа эндотелиальных и опухолевых клеток, что покрытие: 2,5 × 10 5 и 1 × 10 5 клеток соответственно.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа получила щедрую поддержку за счет средств детского онкологического фонда (Балтимор, Мэриленд), Брэндон Ли Кэррингтон Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) и NIH (R01CA108641).
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Антона Wellstein и члены его лаборатории для обмена опытом и помогает нам оптимизировать представленные методы.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
