İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

1. Micropatterns Hücre Hazırlama ve Yayımlama Place 6 plaka 2 bağımsız kuyularda 2 CYTOOchips CYTOOchip sağ alt köşesinde "CYTOO" okumanızı sağlamak. Micropatterns Cy3 veya Cy5 boyalar ile floresan etiketli olabilir. Bu deney için kullanılan CYTOOChips Cy3 floresan etiketli micropatterns var. DİKKAT: karanlıkta fiş tutun. Trypsinization HeLa hücreleri (~% 80 konfluent) toplayın. Mikroskop altında hücrelerin düzgün tripsin tedavisi ile dağınık olduğunu kontrol edin. 4 dakika için 300g hücre toplayın ve santrifüj, sonra yavaşça hücre pelletini tekrar süspansiyon. Hücre sayımı 15.000 hücre / mL tamamlanmış DMEM/F12 kültür ortamı bir konsantrasyon sulandırmak. Iyi bir CYTOOchip içeren her birine 4 ml (60.000 hücreleri) koyun. DİKKAT: plaka, bu merkezindeki hücrelerin konsantre eğiliminde olacaktır ortamda herhangi bir rotasyon hareketlerinin inducing önlemek için mümkün olduğunca az hareket ettirilmelidir. Başlık altında 10 dakika hücreleri tortu sonra hücre inkübatör hareket edelim. 10-20 dakika sonra, hücreler micropatterns uymak başlayacaktır. 10 dakika sonra, mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin. Hücreleri bağlı olarak, hücre orta değiştirmek ve aşağıdaki yordamı kullanarak lamel yüzeyinden nazikçe yıkayın: Plaka düz tutarak, yavaşça kuyunun yanından bir pipet ile orta aspirat. DİKKAT: çip kuru çıkış izin vermeyin, bu tüm sıvı aspire ama her zaman CYTOOchip karşılamak için yeterli asla terk anlamına gelir. 4 mL PBS ekleyin ve sonra kuyu tarafına hareket çip merkezinde başlayan tekrar aspire. Çip havaya maruz kalmadan açıklandığı gibi PBS aspire. 3-4 kez tekrarlayın. Yüzen hücrelerin mikroskop altında kontrol edin: Kayan hücreleri çok sayıda kalırsa, yıkama işlemi tekrarlayın. Çok az sayıda hücre görürseniz, PBS parçası kapalı aspirat ve 2 ml taze orta ile değiştirin. Aspire edin ve iki kez 4 ml taze orta eklemek. 37 ° C 'de üç saatlik bir en az% 5 CO 2 ile hücrelerin yayılmasını tam elde etmek için izin verecek bir doku kültürü inkübatörde plaka yerleştirin. NOT: micropatterns tek bir veya birden fazla hücreleri tarafından işgal edilecektir% 10-30 (2000-6500) arasındaki bu yöntemi kullanarak. DİKKAT: hücreleri yıkama ve her hücre hattı micropatterns üzerinde hücrelerin yayılmasını özgü olacaktır tam için gerekli süre önce uyması için gereken zaman. 2. Blebbistatin Tedavi 17 mM stok solüsyonu elde etmek için% 100 DMSO blebbistatin eritin. % 100 DMSO ile 5 mM daha fazla stok solüsyonu sulandırınız. % 0.1 DMSO 5 mcM blebbistatin nihai bir konsantrasyon elde etmek için kültür ortamında nihai bir seyreltme olun. Kontrol koşulları için 4 ml, sadece% 0.1 DMSO içeren orta hazırlar. Hücreleri üzerinde medya aspire, tedavi ve kontrol koşulları için hazırlanan 4 mL orta ile değiştirin. 1hr inkübe hücreleri 37 ° C 3. Hücre Sabitleme ve Aktin boyanması Çözelti hazırlama hücre sabitleme için Lütfen sitoskeleton tampon (CB) ve% 5 PFA hazırlanması için reaktif bölümüne bakın. CB özellikle aktin filamentler ve mikrotübüller floresan etiketlenmesi için tavsiye edilir. 1xCB-sakaroz hazırlayın: CB 2 mL 1 g sukroz eklemek. Sakaroz İçerme iç hücre yapılarının korunmasına yardımcı olur. PFA-CB-sakaroz% 4 hazırlayın: 4 ml sıcak PFA% 5 1xCB sakkaroz 1 ml ekleyin. DİKKAT: Bu çözüm, 4 ° C sadece bir kaç gün saklanabilir. PFA fiksasyon (Yıkama hariç), 2 mL% 4 PFA-CB-sakaroz çözeltisini içeren bir 6-iyi plaka iyi CYTOO logosu ve yerde bu CYTOOchip almak için forseps RT 10 dakika inkübe PFA-CB-sakaroz çıkarın ve bir kez PBS ile yıkayın Için 10 dakika süreyle 100 mM NH 4 Cl 2 mL artık PFA crosslinking faaliyet gidermek için ikinci bir yıkama yapın NOT: PFA sabit slaytlar, birkaç gün 4 ° C floresan görüntüleme için organel boyama önce PBS saklanabilir . Triton X-100 ile hücre zarı, Permeabilization Deterjan ile hücre Permeabilization antikorlar veya diğer problar hücre zarı nüfuz etmesini sağlar ve hücre iskeleti proteinleri sitozolik havuzu, aksi halde zor yerelleştirme analiz yapma sitoskeletal polimerlerin kontrast azaltabilir bazı ortadan kaldırır. NH 4 Cl çıkarın ve / 2 ml eklemek iyi RT az 3 dakika% 0.1 Triton X-100-CB 2 ml PBS ile iki kez yıkayın. Aktin boyama Floresan-Phalloidin sadece yerli aktin bağlar aktin filamen leke kullanılırts. % 1,5 BSA ile 2 mL PBS içinde 1:2000 sulandırılmış FITC-konjuge Phalloidin 1 saat oda sıcaklığında inkübe 2 ml PBS ile bir kez yıkayın. Çekirdekler boyama 2 mL Hoechst ekle (PBS 1μg / ml ile leke) Oda sıcaklığında 3 dakika inkübe 2 mL PBS ile 2 kez yıkayın Slayt montajı 25-30 Mowiol mcL veya başka herhangi bir montaj çözümü kullanarak standart bir mikroskop lamı üzerine CYTOO logosu ve montaj CYTOOchip CYTOOchips Pick up. 4. Mikroskop Kurulum ve Otomatik Image Acquisition Çok sayıda görüntüleme yazılım paketleri kontrol eden hızlı otomatik görüntü elde etme ve görüntüleme için mikroskop var. Bu örnek Metamorph görüntüleme yazılımları ve otomatik satın almalar, bir CCD Hamamatsu kamera ve bir Intensilight cıva fiber aydınlatma ile donatılmış bir Nikon Eclipse Ti mikroskop yapılmaktadır kullanır. Görüntüler DAPI (çekirdekleri), Cy-3 (micropatterns) ve FITC-Phalloidin (aktin) karşılık gelen üç dalga boylarında da 20x büyütme elde edilir. Alan başına görüntülendi micropatterns sayısı kamera ve objektif kurulumları bağlı olarak değişecektir. CYTOO micropatterns satın alma büyük ölçüde kolaylaştıran çip üzerinde (100 veya 130 mikron) birbirlerine belirli aralıklarla konumlandırılmış. 20x büyütme seçin Açık çok boyutlu Acquisition (Menü çubuğu: Apps / Çok Boyutlu Toplama) ve deney farklı parametrelerini ayarlamak: Dalga boyu sayısı: 3 Dalga boyu türleri: DAPI, FITC, Cy3 Ilk hücre bir alanda odaklanarak her dalga boyu için maruz kalma süresi ayarlayın Otofokus, her dalga boyu yapılabilir Verileri kaydetmek için yeri seçin 12 micropatterns görüntülenebilmekte ve kamera alanı (4 sütun ve 3 satır desen) merkezli böylece Cy3 dalga boyu ve konumu kamera seçin. Çok boyutlu Toplama çalışan bir dergi oluşturun. Şekil 1'de bir dergi oluşturmak için prosedür açıklanmıştır. Açık Tarama aşamasında fonksiyonu (Menü çubuğu: Cihazlar / Sahne / Tarama Sahne). 20x büyütme 24 görüntüleri içeren 12 micropatterns kazanmak için, -400 mikron X adım büyüklüğü ve 300 mikron Y adım boyutu ile 6 sütun ve 4 satır girin. Execute Set Journal dergisinde MDA.JNL yükleyin. Sonra üç dalga boylarında bütün blok otomatik satın alma başlatmak için Scan tuşuna basın. NOT: adım boyutları burada gösterilen X ve Y bir kamera alanında mevcut micropatterns sayısına göre değişir. Doğru yönde hareket için negatif değerler gerekebilir dönemine göre X ve / veya Y, yönünü yukarı ayarlayın. 5. Otomatik Görüntü İşleme ve Analizi Birçok görüntü işleme ve analiz yazılım paketleri mevcut. Işlemler aşağıda anahat görüntü işleme ve açık kaynak programı ImageJ için yazılmış 2 ısmarlama makrolar tarafından gerçekleştirilen analiz adımları nitelendirdi. Ilk makro CellRef Referans Hücre, hücre zarının ikinci hipotenüs önlemler katılık / çöküşü oluşturur. Her ikisi de üzerinde olumsuz etki www.cytoo.com. Micropatterns (makro CellRef) merkezli üç kanal için görüntü yığınlar oluşturun. Micropatterns kullanımı büyük ölçüde tek tek hücrelerin segmentasyon ve lokalizasyon otomatik görüntü işleme ilk adım basitleştirerek, hücre kümeleme ve topaklanma önler. Floresan etiketli micropattern görüntüleri micropatterns merkezli bölgeleri tanımlamak ve sınırlandırmak için kullanılır. Bu bölgeler daha sonra diğer kanallarda elde edilen görüntüler üzerine aktarılması ve kırpılır. Sorumlu kırpılmış görüntüler daha sonra her bir dalga boyu için yığınlarının içine monte edilir. RGB Deste, aynı zamanda üç kanal (Şekil 2) birleştirme oluşturulur. Tek bir hücre seçimi filtre uygulayın (makro CellRef) Yukarıda da belirtildiği gibi, kalan micropatterns boş iken,% 10-30 micropatterns (2.000-6.500), tek bir hücre ya da birden fazla hücreyi tarafından işgal edilmiştir. Sadece tek bir hücre tarafından işgal micropatterns gösteren görüntüleri seçmek için, makro görüntü başına çekirdeklerin sayısını algılar ve bütün yığınları (RGB ve farklı dalga boylarında) bu içeren birden fazla çekirdeği ya da hiç çekirdekleri (Şekil 3) ortadan kaldırır. Normalize olmayan ve tamamen hücre alanı cut-off kullanarak filtre (makro CellRef) micropattern yayılmış değildir hücreleri ortadan kaldırmak Hücrelerin çekirdekleri filtre kaçtı, aktin FITC kanal kullanarak başka bir filtre bölünmesi kaldırmak için uygulanır. Hücre alanı hesaplanır ve tüm yığınlarının altında kalanlar belli bir kesim kapalı (interfaz hücre alanında daha az yaklaşık 2 kat hücre alanları) çıkarılır. Hücre zarfı alan desen boyutuna göre belirlenir. Hücre görüntüler hizalayın (makro CellRef) Önceki adımları, görüntüler tek micropat içerenterned hücreleri seçildi. Bu görüntüler micropatterns merkezli olsa da, hepsi birbirine mükemmel uyumlu asla. Görüntü işleme Sonuç olarak, bir ImageJ eklentisi (MultiStackReg) micropattern pozisyonuna göre tüm toplanan görüntüleri ve tüm kanalları realign uygulanır. Bu adım, şimdi tek bir hücre analizi Referans Hücre veya oluşturma (Şekil 4) için kullanılabilir bireysel görüntüleri uyumlu yığınlar oluşturur Referans Hücre Bina (makro CellRef) Micropatterns üzerinde büyüyen hücreler, tüm hücrelerin benzer şekillerde olması anlamına gelir. Bu normalleşme, birçok hücre görüntüleri kesin bir uyum ve bindirme izin verir. Tüm yığını üzerinden her bir görüntü sinyali Özetle, bir "ortalama bir ilaç etkisi" görselleştirmek ve ölçmek için sağlar. Son genel görüntü veya Referans Hücre temsil ve görüntü analizi için benzersiz ve yararlı bir araçtır ve sadece micropatterned hücreleri (Şekil 4) ile elde edilebilir. ImageJ, Referans Hücre bir yığın filtrelenmiş ve hizalı görüntülerin bir projeksiyon yaparak inşa edilmiştir (Resim> Yığınları> Z-proje). Ortalama veya maksimum yoğunluğu gibi çeşitli projeksiyon yöntemleri uygulanabilir ancak genellikle medyan projeksiyon görüntü yığınının ana aykırı ortadan kaldırır seçilir. Sonuçlarının incelenmesi kolaylaştırmak için renk kodlu bir frekans haritasına monocolor görüntü dönüştürme LUT (Tezgahları) uygulanır. Ölçüm ve niceleme ilgi parametreleri (makro hipotenüs) Tek bir büyük stres elyaf haline aktin hücre iskeletinin organize çünkü bu video makalede, L-micropatterns kullanılır. Hücre iskeletinin blebbistatin Kullanıcı etkisi bu şekilde aktin vurgulayarak, birçok yönden belirlenir: ya da stres lif yoğunluğu, süresini veya kalınlığı boyama aktin stres fiber eğriliği değişiklikleri,, aktin filamentler morfometrik özellikleri değişiklikleri ölçen hücre şekil vb Bu parametreler tek tek hücre görüntüler ya da son Referans Hücre kendisi ya ölçülebilir. Burada, 5 mcM blebbistatin etkisi ikinci bir ImageJ makro (Şekil 7) hipotenüs adlı kullanarak çökmüş hücrelerinin sayısını sayma tarafından karakterize edildi. Kısaca, L-micropattern eşiklenir görüntüleri hücre üçgen şekli teorik bir hipotenüs tanımlamak için kullanılır. Sonra, aktin boyanmış görüntülerin eşikleme yaklaşık gerçek hücre şekli için yapılır. Gerçek içbükey hücre zarı, hücre üçgen ve teorik hipotenüs arasındaki alan ölçülür. Hücre çöktü, teorik hipotenüs altında bir alan belirir. Çökmüş hücrelerinin yüzdesini kontrol karşılaştırmak için kullanılan ve tedavi koşulları. 6. Temsilcisi Sonuçlar Hangi hücrelerin örnekleri hemen micropatterns üzerinde gibi görünmelidir ve 1.6-1.8 açıklanan kritik yıkama adımları birkaç saat sonra, Şekil 5'te gösterilmiştir. CYTOOchips 15 dakika sonra, yuvarlak HeLa hücrelerinde fibronektin micropatterns (Şekil 5a) yapıştırılır belirten eşit mesafelerde görülmektedir. Hücrelerin kültür geminin hafif sallayarak rağmen hareketsiz kalır Yapışma tamamlandı. Birden fazla hücreleri tarafından işgal micropatterns sayısını en aza indirmek için, cips sonra cytophobic alanlar üzerinde yüzen hücreleri çıkarmak için PBS ile temizlendi. Birkaç saat sonra, tam micropatterns gerilir hücreleri Şekil 5b gösterildiği gibi görünecektir. Tipik tek hücre blebbistatin, fiksasyon ve boyama aktin ve çekirdekler ile hücreleri inkübasyondan sonra elde edilen görüntüler Şekil 6'da sunulmaktadır. ImageJ CellRef makro kullanarak birden fazla görüntü ve görüntü işleme otomatik kazanılmasından sonra, renk kodlu bir frekans harita, tüm hücre görüntüleri (6f 6c ve Şekil) üzerinden ortalama aktinin yoğunluğunu gösteriyor oluşturulur. Nontreated ve tedavi koşulları için Referans Hücre karşılaştırılması kolay gözlem altında çalışma fenotipi için bu yaklaşımın potansiyel gösterir ve hücresel ilaç etkileri keşfetmek için özellikle yararlıdır. Olası bir analiz, hücreleri üzerindeki blebbistatin etkisi bir örnek Şekil 7'de sunulmuştur. Çökmüş hücrelerin sayısı (yani teorik hipotenüs altında mevcut boş bir alana sahip hücreler), 50 kontrol hücreleri tespit ve 50 ImageJ hipotenüs makro tarafından tespit edilen 5 mcM blebbistatin ile tedavi hücreleri gösterilir. Blebbistatin tedavi nüfus çökmüş hücrelerinin artan sayıda stres fiberler ve bu nedenle hücre içinde actinomyosin kasılma güçleri blebbistatin inhibisyonu nedeniyle membran gerilimi rahatlama yansıtır. Şekil 1 Metamorph ile yeni bir dergi yaratmak için Prosedür. RakamOtomatik görüntü işleme prosedürü 2. Akış şeması. Şekil 3 tek hücre Filtreleme. Şekil 4 Referans Hücre Bina. Şekil 5 Hücre tohumlama. A) Hela hücreleri B) HeLa hücrelerinde L micropatterns (10x büyütme) yayılmasını tam sonra kızarma adım (4x büyütme) sonra micropatterns yapıştırılır. Şekil 6 kontrolü ve ilaç tedavi koşulları nonpatterned ve micropatterned hücrelerinin karşılaştırılması. HeLa hücreleri 3 saat, 1 saat 5 mcM blebbistatin (alt panel) veya sol tedavi edilmezse (panel üst) numaralı seribaşı ve tedavi edildi. Kontrolü nonpatterned hücreleri (a), aktin 5 mcM blebbistatin (d) ile tedavi üzerine belli belirsiz sökmeye birden fazla liflerinin içine toplanır. L-micropatterns, kontrol hücreleri üçgen bir şekil (b) nonpatterned hücreleri (d) ile karşılaştırıldığında L. 2 uçları dışa arasında büyük bir aktin fiber (stres lif) benimsemek ve geliştirmek, blebbistatin L-micropatterned büyük bir fenotipik değişim indükler hücreleri (e). Ilaç etkileri ve kontrol ve tedavi koşulları karşılaştırma doğrudan görselleştirme 20 hücrelerden inşa Referans Hücre sunumu ile hızlı bir şekilde görüntülendi. Blebbistatin hücrelerin en önemli stres fiber kaybolur çöküşü ve (f) tedavi sırasında bireysel hücrelere benzer şekilde, açık ve yoğun bir stres lif, kontrol Referans Hücre (c) mevcut. Şekil 7, hücreleri üzerindeki makro hipotenüs kullanarak blebbistatin etkilerini bir analiz örneği . Kontrol hücrelerinin% 25'i yıkılmış olsa da, bu zayıflamış actinomyosin kontraktil ağ (n = 50 hücre) yansıtan 5 mcM blebbistatin tedavi edilen hücrelerin% 75 3 kat artmış.