تحسن التصور والتحليل الكمي لتأثيرات الدواء باستخدام خلايا Micropatterned
Summary
ويمكن استخدام المواد اللاصقة التي micropatterns تطبيع العمارة الخليوي لزيادة الحساسية في الكشف عن آثار المخدرات ، وتحسين وتبسيط آلية استنساخ الحصول على الصور وتحليلها. وسوف تستفيد هذه التكنولوجيا المقايسات فحص المخدرات / سيرنا ، التي أجريت على الثقافة التقليدية تدعم الخلايا وبالتالي يعاني من التقلبات الخلية الى خلية المفرطة.
Abstract
حتى الآن ، وتتم معظم HCA (عالية تحليل المحتوى) بدراسات مع خطوط الخلايا الملتصقة نمت على ركيزة متجانسة في الثقافة النسيج المعالجة الدقيقة لوحات. في ظل هذه الظروف ، وتقسيم الخلايا تنتشر في كل الاتجاهات مما أدى إلى تقلب الكامنة في شكل الخلية ، مورفولوجيا والسلوك. ارتفاع الخلية الى خلية الفرق من إجمالي عدد السكان يعوق نجاح HCA ، وخاصة لتطوير العقاقير. قدرة micropatterns لتطبيع شكل والاستقطاب الداخلي من كل خلية فردية يتيح فرصة هائلة لمعالجة هذه اختناق الحاسمة 1-2.
لتسهيل وصول واستخدام تكنولوجيا micropatterning ، وقد وضعت مجموعة من CYTOO جاهزة للاستخدام micropatterns ، متوفرة في أشكال وmicrowell ساترة. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن نقدم بروتوكولات مفصلة لجميع الإجراءات من الخلية في البذر micropatterns CYTOOchip ، العلاج من تعاطي المخدرات ، وتلطيخ لتثبيت اقتناء الآلي ، والآلي ومعالجة الصور وتحليل البيانات النهائية. مع هذا المثال ، نحن لتوضيح كيف يمكن أن تسهل micropatterns خلية مقرها المقايسات. تعديلات في الهيكل الخلوي خلية يصعب قياسها كميا في الخلايا المستزرعة على ركائز متجانسة ، ولكن زراعة الخلايا على النتائج في منظمة micropatterns استنساخه من meshwork أكتين بسبب وضع منهجية للاتصالات التصاق الخلايا في كل خلية هذا التطبيع من بنية الخلايا يسمح الكمي للتأثيرات حتى الصغيرة على الهيكل الخلوي أكتين كما هو موضح في هذه مجموعة من البروتوكولات باستخدام blebbistatin ، مثبط للتفاعل أكتين – الميوسين.
Protocol
1. تحضير الخلايا والبذر على Micropatterns 2 CYTOOchips مكان في 2 آبار مستقلة عن لوحة 6 جيدا ضمان أن تقرأ "CYTOO" في الزاوية اليمنى السفلى من CYTOOchip. يمكن Micropatterns fluorescently المسمى مع Cy3 Cy5 أو الأصباغ. CYTOOChips المستخدمة في هذه التجربة قد Cy3 fluorescently المسمى micropatterns. تنبيه : احتفظ رقائق في الظلام. جمع خلايا هيلا (~ متموجة 80 ٪) من trypsinization. الاختيار تحت المجهر المنتشرة بشكل صحيح بواسطة خلايا لعلاج التربسين. وجمع الخلايا في جهاز الطرد المركزي لمدة 4 دقائق 300g ، ثم resuspend بلطف بيليه الخلية. عدد الخلايا وتمييع لتركيز 15000 خلية / مليلتر في استكمال وسائل الاعلام DMEM/F12 الثقافة. الاستغناء عن 4 مل (60،000 الخلايا) التي تحتوي في كل بئر CYTOOchip. تنبيه : ينبغي أن تنقل لوحة أقل قدر ممكن لتجنب إحداث أي تحركات الدورية في المتوسط لأن هذا سوف تميل إلى تركيز خلايا في المركز. السماح للخلايا الرواسب لمدة 10 دقيقة تحت الغطاء ومن ثم نقلها إلى الخلية الحاضنة. بعد 10-20 دقيقة ، وسوف تبدأ الخلايا التمسك micropatterns. بعد 10 دقيقة ، تحقق بانتظام تحت المجهر. بمجرد أن تعلق الخلايا ، تغيير المتوسطة الخلية وتدفق برفق على سطح ساترة باستخدام الإجراء التالي : الحفاظ على لوحة مسطحة ، ونضح بلطف المتوسطة مع ماصة من جانب البئر. تنبيه : لا تدع إلى شرائح الجافة ، وهذا يعني أبدا نضح تشغيل كافة السائل ولكن ترك ما يكفي لتغطية CYTOOchip في جميع الأوقات. إضافة 4 مل برنامج تلفزيوني ونضح من جديد بدءا الأولى في وسط الشريحة ثم الانتقال إلى جانب البئر. نضح قبالة PBS كما هو موضح دون تعريض الرقاقة للهواء. تكرار 3-4 مرات. الاختيار تحت المجهر لخلايا عائم : إذا كان عدد كبير من الخلايا تبقى عائمة ، كرر الإجراء الغسيل. إذا كنت ترى خلايا قليلة جدا ، ونضح قبالة جزء من برنامج تلفزيوني واستبدالها المتوسطة مل 2 الطازجة. نضح وإضافة 4 مل من المتوسط الطازج مرتين. وضع لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة في 37 درجة مئوية مع CO 2 5 ٪ لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات للسماح للخلايا لتحقيق كامل الانتشار. ملاحظة : استخدام هذا الأسلوب بين 10-30 ٪ (2000-6500) سيكون micropatterns المحتلة من قبل خلايا مفردة أو متعددة. تنبيه : إن الوقت اللازم للخلايا قبل الالتزام خطوة الغسيل والوقت اللازم لنشر كامل من الخلايا على micropatterns ستكون محددة لكل سطر الخلية. 2. Blebbistatin المعاملة حل blebbistatin في DMSO 100 ٪ للحصول على محلول المخزون من 17 ملم. تمييع الحل مزيد من الأسهم إلى 5 ملم مع DMSO 100 ٪. جعل التخفيف النهائية في مستنبت للحصول على التركيز النهائي للblebbistatin ميكرومتر 5 في DMSO 0.1 ٪. لظروف السيطرة ، وإعداد 4 مل من المتوسط تحتوي على 0.1 ٪ فقط DMSO. نضح على الخلايا وسائل الإعلام واستبدالها المتوسطة مل 4 أعدت لظروف المعالجة والسيطرة. احتضان خلايا 1hr عند 37 درجة مئوية. 3. التثبيت الخلية وتلون أكتين إعداد حل لتثبيت الخلية الرجاء راجع المقطع كاشف لإعداد الهيكل الخلوي العازلة (CB) ومنهاج العمل 5 ٪. ويوصى خاصة CB لوصفها مضان من خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة. إعداد 1xCB – السكروز : إضافة 1 غرام من السكروز إلى 2 مل من CB. إدراج السكروز يساعد على الحفاظ على هياكل الخلية الداخلية. إعداد 4 ٪ PFA – CB – السكروز : إضافة 1 مل من السكروز ، 1xCB إلى 4 مل من 5 ٪ PFA الدافئة. تنبيه : يمكن الاحتفاظ هذا الحل في 4 درجات مئوية لبضعة أيام فقط. PFA التثبيت استخدام ملقط لالتقاط CYTOOchip على الشعار ووضعه CYTOO (بدون غسل) في بئر لوحة تحتوي على 6 – جيدا 2 مل من محلول PFA – CB – السكروز 4 ٪ 10 دقيقة في احتضان RT إزالة PFA – CB – السكروز ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لا يغسل الثانية مع 2 مل من الكلور 100 NH 4 ملم لمدة 10 دقيقة من أجل إخماد النشاط المتبقية يشابك PFA ملاحظة : يمكن تخزين الشرائح PFA ثابتة في برنامج تلفزيوني لعدة أيام في 4 درجات مئوية قبل تلطيخ عضية للتصوير الفلورسنت. Permeabilization من غشاء الخلية مع تريتون X – 100 Permeabilization من الخلايا مع المنظفات يسمح الأجسام المضادة أو تحقيقات أخرى لاختراق غشاء الخلية ويقضي على بعض من البروتينات عصاري خلوي بركة الهيكل الخلوي الذي يمكن ان يحد ذلك على النقيض من البوليمرات هيكل الخلية مما يجعل من الصعب تحليل الترجمة الخاصة بهم. إزالة NH 4 Cl و إضافة 2 مل / 0.1 ٪ جيدا تريتون X – 100 – CB لمدة 3 دقائق على RT تغسل مرتين مع PBS مل 2 أكتين تلطيخ فلوري ، phalloidin الذي يربط أكتين الأصلي فقط يستخدم لصبغ أكتين filamenTS. إضافة 2 مل من FITC – مترافق phalloidin المخفف 1:2000 في برنامج تلفزيوني مع ديوان الرقابة المالية 1.5 ٪ ح 1 في احتضان RT يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مل 2 نوى تلطيخ إضافة 2 مل من هويشت (وصمة عار مع 1μg / مل في برنامج تلفزيوني) 3 دقائق في احتضان RT غسل 2 مرات مع PBS مل 2 تزايد شريحة التقط CYTOOchips على شعار CYTOO وCYTOOchip جبل على شريحة المجهر قياسي باستخدام 25-30 ميكرولتر من Mowiol أو أي حل آخر في تصاعد مستمر. 4. إعداد المجهر الآلي والحصول على الصور العديد من حزم البرامج التي تتحكم في التصوير وجود المجهر لسرعة الحصول على الصور الآلي وعرضه. هذا المثال يستخدم التصوير Metamorph البرمجيات ويتم تنفيذ عمليات الاستحواذ التلقائي على نيكون المجهر تي الكسوف مجهزة بكاميرا CCD هاماماتسو والزئبق من الألياف منار Intensilight. يتم الحصول على الصور 20X التكبير في ثلاث موجات المقابلة لدابي (نوى) ، CY – 3 (micropatterns) وFITC – Phalloidin (أكتين). تصور عدد micropatterns لكل حقل ستختلف تبعا لكاميرا والاجهزة الهدف. متوضعة micropatterns CYTOO على فترات محددة عن بعضها البعض (100 أو 130 ميكرون) عبر شرائح يسهل كثيرا الاستحواذ. حدد التكبير 20X المتعددة الأبعاد اقتناء فتح (في شريط القوائم : تطبيقات / اقتناء متعددة الأبعاد) ، وإعداد المعلمات مختلفة من التجربة : عدد من موجات : 3 أنواع الطول الموجي : دابي ، FITC ، Cy3 تعيين وقت التعرض لكل طول موجي من خلال التركيز أولا على حقل من الخلايا لا يمكن أن يؤديها أوتوفوكس على كل طول موجي حدد المكان لحفظ البيانات حدد Cy3 الطول الموجي وموقف الكاميرا بحيث أن 12 micropatterns وتصور ، وتركزت في مجال الكاميرا (4 أعمدة و 3 صفوف من أنماط). إنشاء مجلة اقتناء تشغيل متعدد الأبعاد. ووصف الإجراء لإنشاء المجلة في الشكل 1. فتح مرحلة مهمة المسح الضوئي (في شريط القوائم : أجهزة / المرحلة مرحلة / المسح الضوئي). للحصول على 24 لوحات تحتوي كل منها على 12 في micropatterns 20X التكبير ، أدخل 6 الأعمدة والصفوف 4 مع حجم -400 ميكرون X خطوة خطوة و 300 Y حجم ميكرون. في مجلة لتنفيذ مجموعة ، وتحميل MDA.JNL المجلة. ثم اضغط على المسح الضوئي للبدء في اكتساب الآلي للكتلة كاملة في موجات الثلاثة. ملاحظة : X و Y أحجام خطوة تشير هنا سوف تختلف وفقا لعدد من micropatterns موجودة في حقل الكاميرا. مجموعة اعتمادا على خشبة المسرح الخاص بك ، في الاتجاه و / X أو Y قد تتطلب القيم السلبية للحركة في الاتجاه الصحيح. 5. الآلي لمعالجة الصور وتحليل العديد من حزم البرمجيات ومعالجة الصور وتحليل الوجود. ووصف الإجراءات أدناه الخطوط العريضة لمعالجة الصور وتحليل الخطوات التي تقوم بها وحدات الماكرو المخصصة الصنع 2 الكتابي لبرنامج مفتوح المصدر ImageJ. وCellRef الماكرو الأول بإنشاء خلية المرجعي ، والثانية صلابة التدابير وتر / انهيار غشاء الخلية. كلا متاحة عند الطلب من خلال www.cytoo.com . إنشاء مداخن صورة لجميع القنوات الثلاث تتمحور حول micropatterns (ماكرو CellRef). يتجنب استخدام micropatterns الخلية التكتلات والتثاقل ، وتبسيط بشكل كبير الخطوة الأولى في معالجة الصور الآلي الذي هو التوطين والتقسيم من الخلايا الفردية. يتم استخدام الصور micropattern fluorescently المسمى لتحديد وترسيم المناطق تركزت على micropatterns. ثم تم نقل هذه المناطق على الصور المكتسبة في القنوات الأخرى ، واقتصاص. ثم يتم تجميعها في المناظرة الصور اقتصاص كدسات لكل طول موجي. يتم أيضا إنشاء RGB كومة من الدمج بين القنوات الثلاث (الشكل 2). وحيد الخلية تطبيق اختيار مرشح (ماكرو CellRef) كما هو مبين أعلاه ، فإن 10-30 ٪ المحتلة (2000-6500) من micropatterns بواسطة خلية واحدة أو عدة خلايا ، في حين أن micropatterns المتبقية هي فارغة. لاختيار الصور التي تظهر micropatterns التي تحتلها خلية واحدة فقط ، الماكرو بالكشف عن عدد من النوى في الصورة ويزيل كل من (RGB وأطوال موجية مختلفة) مداخن تلك النواة التي تحتوي على أكثر من نوى أو لا (الشكل 3). القضاء غير طبيعية ، والخلايا التي ليست بكامل طاقتها عبر micropattern باستخدام خلية قطع ناحية التصفية (ماكرو CellRef) لإزالة تطبيق تقسيم الخلايا التي من شأنها أن فروا من تصفية النوى ، مرشح آخر باستخدام قناة FITC لأكتين. ويتم احتساب مساحة الخلية وتتم إزالة تلك أدناه المعزولة معينة (مناطق الخلية حوالي 2 مرات أقل من منطقة الطور البيني الخلية) من جميع المداخن. يتم تحديد منطقة المغلف الخلية حسب حجم هذا النمط. محاذاة الخلية صور (ماكرو CellRef) من الخطوات السابقة ، والصور التي تحتوي على واحد micropatوقد تم اختيار الخلايا terned. على الرغم من وتتركز هذه الصور على micropatterns ، فهي لم تتماشى تماما عن بعضها البعض. اختتام معالجة الصور ، وهو البرنامج المساعد ImageJ (MultiStackReg) هو تطبيق لإعادة تنظيم جميع الصور التي تم جمعها والقنوات كلها ترتكز على موقف micropattern. هذه الخطوة بإنشاء كدسات محاذاة الصور الفردية التي يمكن أن تستخدم الآن لتحليل خلية واحدة أو إنشاء مرجع خلية (الشكل 4) بناء خلية المرجعي (ماكرو CellRef) الخلايا المتزايد على micropatterns يعني أن كل الخلايا لها أشكال مشابهة. هذا التطبيع تصاريح محاذاة دقيقة وتراكب الصور الخلية كثيرة. تلخيصا للإشارة في كل صورة على المكدس كله يسمح احد لتصور وقياس "تأثير المخدرات في المتوسط". الصورة النهائية الشاملة أو خلية المرجعية هي أداة فريدة ومفيدة للتمثيل وتحليل الصور ويمكن الحصول عليها إلا مع الخلايا micropatterned (الشكل 4). في ImageJ ، يتم إنشاء مرجع الخلية عن طريق الإسقاط من الصور وتصفيتها من محاذاة كومة (صورة> مداخن> Z – المشروع). ويمكن تطبيق أساليب الإسقاط عدة مثل كثافة متوسط أو الحد الأقصى ولكن عادة ما يتم اختياره من الإسقاط المتوسط الذي يلغي القيم المتطرفة الرئيسية للمكدس الصورة. لتسهيل النظر في النتائج ، ويتم تطبيق طرفية (البحث عن جداول) تحويل الصور إلى خريطة monocolor تردد مرمزة. قياس الكمي والمعلمات من الفائدة (وتر الماكرو) في هذه المقالة الفيديو ، تستخدم L – micropatterns لأن تنظم شكل الهيكل الخلوي الأكتين إلى الألياف إجهاد كبير واحد. من خلال تسليط الضوء أكتين بهذه الطريقة ، يمكن تحديد تأثير blebbistatin على الهيكل الخلوي في نواح عديدة : قياس التغيرات في انحناء أكتين الألياف الإجهاد ، وتلطيخ كثافة وطول أو سمك الألياف الإجهاد ، وتغييرات في ملامح morphometric من شعيرات الأكتين أو يمكن أن الخلية شكل الخ تقاس هذه المعلمات إما على صور زنزانة فردية أو على مرجع الخلية النهائية نفسها. هنا ، اتسم تأثير blebbistatin 5 ميكرومتر من خلال إحصاء عدد الخلايا انهارت في الثانية باستخدام الماكرو المسمى ImageJ وتر (الشكل 7). لفترة وجيزة ، وتستخدم الصور thresholded من L – micropattern لتعريف النظرية للوتر الخلية شكل مثلث. المقبل ، يتم تنفيذ thresholding من الصور الملطخة أكتين من أجل تقريب شكل الخلية الفعلي. يقاس ثم المنطقة الواقعة بين النظرية وتر المثلث الخلية وغشاء الخلية الفعلي مقعرة. عندما انهار الخلية ، وهي منطقة تحت وتر النظرية تظهر. وتستخدم نسبة من الخلايا انهار لمقارنة التحكم والمعالجة شروطه. 6. ممثل النتائج أمثلة على ما ينبغي أن تبدو مثل الخلايا على micropatterns فورا وتظهر بعد عدة ساعات من الخطوات الحاسمة الغسيل وصفها في 1،6-1،8 ، في الشكل 5. بعد 15 دقيقة على CYTOOchips ، يلاحظ الجولة خلايا هيلا على مسافات متساوية تشير إلى أنها انضمت إلى micropatterns فبرونيكتين (الشكل 5A). التصاق الخلايا عند اكتمال يبقى طيف ثبتوا على الرغم من اهتزاز للسفينة الثقافة. لتقليل عدد micropatterns المحتلة من قبل خلايا متعددة ، ثم يتم مسح رقائق مع برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا تطفو فوق مناطق cytophobic. بعد عدة ساعات ، والخلايا التي تعمل بكامل طاقتها خلال micropatterns تبدو مثل تلك التي تظهر في الشكل 5B. وتعرض الصور النمطية خلية واحدة بعد الحصول على حضانة الخلايا مع التثبيت ، وتلون blebbistatin أكتين والنوى في الشكل 6. بعد اقتناء الآلي من الصور المتعددة ومعالجة الصور باستخدام CellRef ImageJ الماكرو ، يتم إنشاء خريطة مرمزة تردد أن يصور بلغ متوسط كثافة أكتين على جميع الصور الخلية (الشكل 6C و6F). المقارنة بين الخلية المرجعية لظروف ومعاملة nontreated يبين المحتملة لهذا النهج لمراقبة سهلة من النمط الظاهري قيد الدراسة ومفيد خصوصا لاستكشاف آثار المخدرات الخلوية. ويقدم مثالا واحدا من الممكن تحليل تأثير على الخلايا blebbistatin في الشكل 7. وانهار عدد من الخلايا (خلايا أي. بمساحة فارغة القائمة في إطار نظرية الوتر) الكشف عن التحكم في الخلايا 50 و 50 خلية يظهر تعامل مع blebbistatin 5 ميكرومتر والكشف عنها بواسطة الماكرو وتر ImageJ. زيادة عدد الخلايا انهارت في معاملة السكان blebbistatin يعكس الاسترخاء من الألياف الضغط والتوتر وبالتالي في الغشاء بسبب تثبيط blebbistatin القوات actinomyosin مقلص داخل الخلية. الشكل 1. الإجرائية لإنشاء مجلة جديدة مع Metamorph. شخصية2. مخطط تدفق الإجراء معالجة الصور التلقائي. الشكل 3. تصفية واحدة من الخلايا. الشكل 4 : بناء خلية مرجع. الشكل 5. بذر الخلية. أ) الخلايا الحله تلتزم micropatterns بعد خطوة التنظيف (التكبير 4X) ب) خلايا هيلا بعد نشر كامل على micropatterns L (التكبير 10x). الشكل 6. مقارنة بين الخلايا وnonpatterned micropatterned في مجال مكافحة المخدرات وظروف المعالجة. وكانت المصنفة خلايا هيلا لمدة 3 ساعات وتعامل مع blebbistatin ميكرومتر (5) ل1 ساعة (اللوحة السفلى) أو تركت دون علاج (العلوي لوحة). التحكم في الخلايا nonpatterned (أ) ، تجمع الأكتين إلى ألياف المتعددة التي تفكيكه بصورة تدريجية على العلاج مع blebbistatin ميكرومتر 5 (د). على L – micropatterns ، وخلايا مكافحة اعتماد شكل الثلاثي (ب) ووضع الألياف أكتين الرئيسية (الألياف الإجهاد) بين قمم 2 من L. بالمقارنة مع الخلايا nonpatterned (د) ، blebbistatin يؤدي الى تغيير كبير في المظهري L – micropatterned الخلايا (ه). ويمكن رؤية مباشرة من آثار المخدرات والمقارنة بين الرقابة والشروط تصور تعامل بسرعة مع تقديم مرجع خلية بنيت من 20 زنزانة. تشبه الخلايا الفردية ، والألياف واضحة وشديدة التوتر موجود على السيطرة مرجع الخلية (ج) ، في حين يعامل blebbistatin انهيار الخلايا والألياف يختفي التوتر الرئيسية (و). الشكل 7. مثال لتحليل آثار blebbistatin على الخلايا باستخدام Hypothenuse الماكرو. بينما انهارت 25 ٪ من الخلايا السيطرة ، وهذا زاد 3 أضعاف لتصل إلى 75 ٪ في الخلايا المعالجة 5 ميكرومتر blebbistatin يعكس ضعف actinomyosin مقلص شبكة (ن = 50 خلية).
Discussion
اختيار micropattern
في حين أن آثار blebbistatin 5 ميكرومتر وبالكاد يمكن كشفها على يدعم الثقافة الموحدة ، وتحديد كفاءة ممكنة على micropatterns التي تركز الأكتين إلى الألياف إجهاد كبير واحد. يعزز هذا التصور من الهيكل الخلوي أكتين مساعدة تقدير دقيق للآثار blebbistatin على الخلية. اختيار الشكل micropattern أمر بالغ الأهمية في تصميم وفحص ومصممة وفقا لتغير المظهري يتعين إبرازها في هذه الدراسة.
الاستنتاجات
Micropatterns تسهيل التصور والكمي للآثار المخدرات ، وخصوصا في تركيزات منخفضة. استبدال ركائز مستو متجانسة مع micropatterns لاصقة لخلية مقرها المقايسات يحسن دقة وحساسية ونوعية البيانات المنتجة. نتيجة لذلك ، هناك حاجة لعدد أقل من الخلايا لتحليلها من أجل تحقيق نتائج قوية الإحصائية 3. micropatterns لاصقة توفر فرصة حقيقية لتحسين الدراسات الفنية واستكشاف التغيرات المظهرية بتركيزات أقل المخدرات من أجل تجنب إحداث آثار المخدرات السامة أو غير مباشر. إذا كنت تستخدم منصات فحص كافية ، يمكن micropatterns تلبية مطالب شركات الأدوية لتحسين تطبيقات الفحص الجيني / المخدرات. وذكرت بعض الأمثلة الإضافية من المطبوعات الحديثة التي تستغل micropatterns لتحليل وقياس ظاهرة الخلوية 3-13 أدناه.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |
| Cell culture | ||||
| CYTOOchips 20×20 L-M-FN | CYTOO | 10-114 | CYTOOchips are available for adsorption of the protein of your choice | |
| PBS 1x | Gibco | 14040-091 | ||
| Counting chamber (Kova slide) | Prolabo | 71287.01 | ||
| DMEM/F-12 + Glutamax-I | Gibco-Invitrogen | 25300-054 | ||
| FBS (f tal bovine serum) | PAA | 31331-028 | ||
| Penicillin & Streptomycin | PAA | A15-101 | ||
| 6 wells-plate | Dutscher | 353046 | ||
| centrifuge | Fisher Scientific | M65838 | ||
| Microscope | Nikon | |||
| Drugs, fixation and immunostaining | ||||
| Cytoskeleton Buffer 1X (CB) | Sigma | MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889 |
10 mM MES pH 6.1, 138mM KCl, 3mM MgCl, 2mM EGTA |
|
| Sucrose | Sigma | S2395 | ||
| PFA 32 % | Electron Microscopy Sciences | 15714 | ||
| PFA 5% | Mix 10 mL of PFA 32% with 54 mL of CB 1.185X | |||
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | ||
| PBS tablets | Gibco-Invitrogen | 18912-014 | ||
| Bovin serum albumin (BSA) | Sigma | A7806 | ||
| Phallodin-FITC | Sigma | P5282 | ||
| Hoescht | Invitrogen | H3570 | ||
| Blebbistatin | Euromedex | BN0640 | ||
| DMSO | Sigma | D8418 | ||
| NH4Cl 0.1M | Sigma | M11209 | ||
| Image Acquisition | ||||
| Epifluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ti | ||
| CCD Camera | TBC | TBC | ||
| ImageJ Software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |||
References
- Thery, M. The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis. Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).
- Thery, M. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).
- Schauer, K. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nat Methods. , (2010).
- Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape. Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity. J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).
- Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction. J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).
- Kwon, M. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).
- Nelson, C. M. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).
- Pouthas, F. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).
- Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation. Nature. 447, 493-496 (2007).
- Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).
Tags
VisualizationQuantitative AnalysisDrug EffectsMicropatterned CellsHCA (High Content Analysis)Adherent Cell LinesHomogenous SubstrateCell ShapeMorphologyBehaviorCell-to-cell VarianceMicropatternsShape NormalizationInternal PolarityCYTOOMicropatterning TechnologyCell SeedingDrug TreatmentFixation And StainingAutomated AcquisitionAutomated Image ProcessingData AnalysisCell CytoskeletonActin Meshwork
Cite This Article
Degot, S., Auzan, M., Chapuis, V., Béghin, A., Chadeyras, A., Nelep, C., Calvo-Muñoz, M. L., Young, J., Chatelain, F., Fuchs, A. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514, doi:10.3791/2514 (2010).