Улучшенная Визуализация и количественный анализ на наркотики эффекты с помощью Micropatterned Клетки

1. Подготовка клетки и посев на Micropatterns Место 2 CYTOOchips в 2 независимых скважин 6 лунками гарантируя, что вы читали "CYTOO" в нижнем правом углу CYTOOchip. Micropatterns могут быть помечены флуоресцентно Cy3 или Cy5 красителей. CYTOOChips использоваться для этого эксперимента Cy3 флуоресцентно меченных micropatterns. ВНИМАНИЕ: Хранить чипов в темноте. Сбор HeLa клетки (~ 80% сливной) по трипсинизации. Проверьте под микроскопом, что клетки, правильно разогнаны лечения трипсина. Сбор и центрифуги клеток в 300 г в течение 4 минут, затем осторожно ресуспендируют осадок клеток. Граф клеток и разбавить до концентрации 15 000 клеток / мл в завершена СМИ DMEM/F12 культуры. Внесите 4 мл (60 000 клеток) в каждую лунку содержащие CYTOOchip. ВНИМАНИЕ: пластинка должна быть перенесена как можно меньше, чтобы избежать вызывать любые вращающиеся движения в среде, как это будет иметь тенденцию концентрироваться клетки в центре. Пусть клетках осадка в течение 10 мин под капотом затем переместить их в ячейку инкубатора. Через 10-20 мин, клетки начнут придерживаться micropatterns. Через 10 мин, регулярно проверять под микроскопом. Как только клетки придают, изменения клеточной среде и осторожно промыть покровное поверхности, используя следующую процедуру: Сохранение плоской пластины, мягко аспирата среде с пипеткой со стороны хорошо. ВНИМАНИЕ: Никогда не позволяйте чип сухим, это означает, никогда не аспирата себя все жидкости, но оставить достаточно, чтобы покрыть CYTOOchip во все времена. Добавить 4 мл PBS и аспирации снова первый, начиная с центра чипа затем перейти на сторону хорошо. Аспирацию с PBS, как описано, не подвергая чип с воздухом. Повторить 3-4 раз. Проверьте под микроскопом плавающие клетки: Если большое количество плавающих клеток остаются, повторите процедуру промывки. Если вы видите, очень мало клеток, аспирата с частью PBS и заменить его на 2 мл свежей среды. Аспирацию и добавить 4 мл свежей среды, в два раза. Место пластины в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2 в течение минимум трех часов, чтобы позволить клеткам для достижения полного распространения. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании этого метода в пределах 10-30% (2000-6500) micropatterns будет занята одной или нескольких клеток. ВНИМАНИЕ: время, необходимое для клеток придерживаться до промывки и время, необходимое для полного распространения клеток на micropatterns будут специфичны для каждой клеточной линии. 2. Лечение Blebbistatin Растворите blebbistatin в 100% ДМСО для получения исходного раствора 17 мм. Разбавьте исходный раствор дальнейшем до 5 мм со 100% ДМСО. Сделать окончательное растворение в культуральной среде для получения конечной концентрации 5 мкМ blebbistatin в 0,1% ДМСО. Для контроля условий, подготовить 4 мл среды, содержащей 0,1% ДМСО только. Аспирируйте СМИ на клетки и замените ее на 4 мл среды подготовлен для обработанных и контрольных условиях. Инкубируйте клетки для 1 час при температуре 37 ° C. 3. Фиксация клеток и окрашивание актина Решение подготовка к фиксации клеток Пожалуйста, смотрите раздел реагентов для подготовки цитоскелета буфера (ЦБ) и PFA 5%. CB особенно рекомендуется для флуоресцентной маркировки актиновых филаментов и микротрубочек. Подготовка 1xCB-сахарозы: добавить 1 г сахарозы до 2 мл ЦБ. Включение сахароза способствует сохранению внутренней структуры клетки. Подготовка 4% PFA-CB-сахарозы: Добавить 1 мл 1xCB-сахарозы до 4 мл теплой PFA 5%. ВНИМАНИЕ: Это решение может храниться при 4 ° С в течение нескольких дней. PFA фиксации Используйте пинцет, чтобы забрать CYTOOchip на логотип CYTOO и поместить его (без промывки) в скважине 6-луночный планшет, содержащий 2 мл 4% PFA-CB-раствором сахарозы Инкубировать 10 минут при комнатной температуре Удалить PFA-CB-сахарозы и мыть один раз с PBS У второго промыть 2 мл 100 мМ NH 4 Cl в течение 10 минут для того, чтобы утолить остаточной сшивания PFA деятельности ПРИМЕЧАНИЕ: PFA фиксированной слайды могут быть сохранены в PBS в течение нескольких дней при температуре 4 ° С до органелл окрашивания для люминесцентных изображений. Пермеабилизации клеточной мембраны с Triton X-100 Пермеабилизации клеток с моющим средством позволяет антител или других зонда проникнуть клеточную мембрану и устраняет некоторые из цитозольного бассейн цитоскелета белков, которые в противном случае могут уменьшить контрастность цитоскелета полимеров что затрудняет анализ их локализации. Удалить NH 4 Cl и добавьте 2 мл / лунку 0,1% Тритон Х-100-КБ в течение 3 минут при комнатной температуре Промыть два раза с 2 мл PBS Актина окрашивание Флуоресцентные-фаллоидином, который связывается с родной актина только используется для окраски актина нитевидныхтс. Добавить 2 мл FITC-сопряженных фаллоидином разбавленный 1:2000 в PBS с 1,5% BSA Инкубируйте 1 час при комнатной температуре Вымойте сразу с 2 мл PBS Окрашивание ядер Добавить 2 мл Hoechst (пятно с 1 мкг / мл в PBS) Инкубируйте 3 минут при комнатной температуре Мыть 2 раза с 2 мл PBS Монтаж слайд Возьмите CYTOOchips на логотип CYTOO и смонтировать CYTOOchip на стандартную микроскопический слайд использованием 25-30 мкл Mowiol или любого другого решение для монтажа. 4. Установка микроскопа и автоматизированного захвата изображений Многочисленные пакеты ПО для обработки изображений, что контроль существует микроскоп для быстрого автоматизированного захвата изображений и показа. Этот пример использует Метаморф обработки изображений и автоматическое приобретение осуществляется на Nikon Eclipse Ti микроскоп с ПЗС-камерой Hamamatsu и Intensilight ртути волокна осветителя. Изображения, полученные в 20-кратным увеличением в трех длинах волн, соответствующих DAPI (ядер), Су-3 (micropatterns) и FITC-фаллоидином (актин). Число micropatterns визуализируется на поле будет меняться в зависимости от камеры и объективной установок. CYTOO micropatterns расположены через определенные интервалы времени друг от друга (100 или 130 мкм) через чип существенно облегчает приобретение. Выберите 20-кратным увеличением Открытое Многомерные Acquisition (в строке меню: приложения / Многомерные Acquisition) и настроить различные параметры эксперимента: Количество волн: 3 Длина волны типа: DAPI, FITC, Cy3 Установить время экспозиции для каждой длины волны, сначала упором на поле клеток Автофокус может быть выполнено на каждой длине волны Выберите путь для сохранения данных Выберите Cy3 длину волны и положение камеры так, что 12 micropatterns визуализируются с центром в камере поле (4 столбцов и 3 ряда моделей). Создать журнал работает Многомерные Приобретения. Процедура создания журнала описана на рисунке 1. Открытая стадия Функция сканирования (в строке меню: Приборы / Stage / сканирования область). Чтобы получить 24 изображений каждый из которых содержит 12 micropatterns на 20-кратным увеличением, ввести 6 столбцов и 4 строк с -400 мкм X размер шага и 300 мкм Y размера шага. В Установить Journal от исполнения, загружать журнал MDA.JNL. Затем нажмите кнопку Scan, чтобы начать автоматизированных приобретение целого блока в трех длинах волн. ПРИМЕЧАНИЕ: X и Y шаг размеры, указанные здесь, будут варьироваться в зависимости от числа micropatterns присутствует в камере поле. В зависимости от стадии настройки, направление в X и / или Y может потребовать отрицательные значения для движения в правильном направлении. 5. Автоматизированные системы обработки и анализа изображений Многие пакеты обработки изображений и анализа программного обеспечения существует. Процедуры, описанные ниже, изложена обработки и анализа изображений шаги, выполняемые 2 заказные макросы, написанные для программы с открытым исходным кодом ImageJ. Первый CellRef макрос создает ссылку на ячейку, второй Гипотенуза меры жесткости / распада клеточной мембраны. Оба доступны по запросу www.cytoo.com . Создать образ стеки для всех трех каналов сосредоточены на micropatterns (макро CellRef). Использование micropatterns избегает ячейки кластеризации и комков, что значительно упрощает первый шаг в автоматизированной обработки изображения, которое является локализация и сегментация отдельных клеток. Флуоресцентно меченных micropattern изображения используются, чтобы определить и разграничить регионах сосредоточены на micropatterns. Эти регионы, то транспонированная на изображения, полученные в других каналов и обрезаются. Корреспондент обрезать изображения потом собираются в стек для каждой длины волны. RGB-стек также создан из слияния трех каналов (рис. 2). Применение одной ячейки выбора фильтра (макро CellRef) Как указывалось выше, на 10-30% (2000-6500) из micropatterns занимают одну ячейку или несколько ячеек, в то время как остальные micropatterns пусты. Для выбора изображений, которые показывают, micropatterns занимают только одну ячейку, макрос определяет число ядер в изображения и исключает из всех стеков (RGB и разных длин волн), содержащих более одного ядра или нет ядер (рис. 3). Ликвидация ненормированного и клетки, которые не полностью тянулись micropattern использованием пороговых площадью ячейки фильтра (макро CellRef) Для удаления делящихся клеток, которые избежали ядер фильтра, другой фильтр, используя FITC канал для актина применяется. Сотовые площадь рассчитывается и тех, кто ниже определенного с разрезом (ячеек, которые примерно в 2 раза меньше, чем межфазной области ячейки) будут удалены из всех стеков. Области клеточной оболочки определяется размер узора. Выравнивание ячейки изображения (макро CellRef) Из предыдущих шагов, изображений, содержащих одну micropatterned клетки отбирали. Даже если эти изображения сосредоточены на micropatterns, они никогда не все идеально ровные друг к другу. В заключение обработки изображений, ImageJ плагин (MultiStackReg) применяется, чтобы перестроить все собранные образы и всех каналов, основываясь на положении micropattern. Этот шаг создает выровнены стеки отдельных изображений, которые теперь могут быть использованы для анализа одной ячейки или создание ссылки на ячейки (рис. 4) Строительство ссылка на ячейку (макро CellRef) Рост клеток на micropatterns означает, что все клетки имеют одинаковую форму. Такая нормализация позволяет точного выравнивания и наложения многих образов клетки. Подводя итоги сигнала в каждом изображении более всего стека позволяет визуализировать и измерить "средний эффект наркотиков". Окончательный общий образ или ссылкой на ячейку является уникальным и полезным инструментом для представления и анализа изображений и может быть получена только с клетками micropatterned (рис. 4). В ImageJ, ссылка на ячейку построено, делая проекцию фильтруется и приведены в соответствие изображения из стека (Image> Стеки> Z-проект). Несколько способов проецирования могут быть применены такие как средний или максимальной интенсивности, но обычно средний проекции выбирается который устраняет основные выбросы образа стека. Чтобы облегчить изучение результатов, LUT (Look Up Tables) преобразования Моноколор изображение в цветной карте частоты применяется. Измерение параметров и количественной оценки интереса (макро Гипотенуза) В этом видео статьи, L-micropatterns используются, потому что форма организует актина цитоскелета в одной крупной волокна стресса. Подчеркивая актина, таким образом, влияние blebbistatin на цитоскелета может быть определена по-разному: измерения изменений в кривизне напряжение в волокне актин, интенсивность окрашивания, длина или толщина стресс волокна, изменений морфометрических особенностей актиновых нитей или др. формы клеток Эти параметры могут быть измерены либо на отдельных изображений ячейки или на конечный Ссылка на ячейку себя. Здесь воздействие 5 мкМ blebbistatin характеризовался подсчет количества разрушенных клеток с использованием второго ImageJ макрос с именем Гипотенуза (рис. 7). Короче говоря, thresholded образы L-micropattern используются для определения теоретической гипотенузы форму треугольника клетки. Затем порог образов актина окрашенных производится для того чтобы приблизиться фактическую форму клетки. Область между теоретической гипотенузы треугольника клеток и фактические вогнутой клеточной мембраны затем измеряется. Когда клетка находится в упадке области под теоретические гипотенузы появляется. Процент рухнул клетки используется для сравнения контроль и лечение условий. 6. Представитель Результаты Примеры того, что клетки должны выглядеть на micropatterns сразу и через несколько часов после критических шагов стиральной описано в 1.6-1.8, показаны на рисунке 5. Через 15 минут на CYTOOchips, круглых клеток HeLa наблюдается на равных расстояниях указанием, что они присоединились к фибронектина micropatterns (рис. 5а). Адгезия считается завершенным, когда клетки остаются иммобилизованными несмотря на нежный сотрясение культуры судна. Чтобы свести к минимуму число micropatterns занимают несколько ячеек, чипсы, затем промыть, чтобы удалить PBS клетки парит над cytophobic областях. После нескольких часов, клетки, которые полностью натянутой micropatterns будет выглядеть так, как показано на рисунке 5б. Типичные одиночных изображений ячейки, полученные после инкубации клеток с blebbistatin, фиксации и окраски актина и ядер приведены на рисунке 6. После автоматизированного приобретения нескольких изображений и обработки изображений с использованием ImageJ CellRef макрос, цветные частоты карты генерируется, которая изображает интенсивность актина усредненные по всем ячейка изображения (рис. 6 и 6f). Сравнение ссылкой на ячейку для необработанном виде рассматриваются условия показывает потенциал этого подхода для удобного наблюдения фенотип изучается, и особенно полезен для изучения клеточных эффектов препарата. Пример одного из возможных анализ влияния на клетки blebbistatin представлена ​​на рисунке 7. Число разрушенных клеток (т.е. клеток с пустой области существующее в соответствии с теоретическими гипотенузы) обнаружен в 50 контрольными клетками и 50 клеток, обработанных 5 мкМ blebbistatin, обнаруженных макросов Гипотенуза ImageJ это показано на рисунке. Увеличение числа клеток в рухнули blebbistatin лечение населения отражает релаксацию напряжения волокон и, следовательно, напряжение на мембране из-за blebbistatin торможение actinomyosin сократительной силы внутри клетки. Рисунок 1. Процедуру, чтобы создать новый журнал с Метаморф. Фигура2. Блок-схема процедуры автоматической обработки изображений. Рисунок 3. Фильтрация из отдельных клеток. Рисунок 4. Создание ссылки на ячейку. Рисунок 5. Сотовый посева. ) Hela клетки придерживался micropatterns после промывки шаг (4x увеличение) Б) HeLa клетки после полного распространения на micropatterns L (10x увеличение). Рисунок 6. Сравнение nonpatterned и micropatterned клетки в контроле и наркотиков рассматривается условиях. HeLa клетки высевали на 3 часа и обрабатывают 5 мкМ blebbistatin в течение 1 часа (нижняя панель) или не лечить (верхняя панель). В контрольных клетках nonpatterned (а), актин собирает на несколько волокон, которые незаметно разобрать на лечение с 5 мкМ blebbistatin (г). Об L-micropatterns, контрольные клетки принимают треугольную форму (б) и разработка основных волокна актина (стресс волокна) между 2 вершинами из L. По сравнению с nonpatterned клеток (г), blebbistatin вызывает основные фенотипические изменения на L-micropatterned клеток (е). Прямая визуализация эффектов наркотиков и сравнение контроля и рассматриваются условия могут быть визуализированы быстро презентации ссылку на ячейку построен из 20 ячеек. Как и в отдельных клетках, четкий и интенсивный стресс волокна присутствует на сотовый контроль задание (с), в то время как blebbistatin обработанных клеток коллапс и основные волокна стресс исчезает (е). Рисунок 7. Пример анализа последствий blebbistatin на клетки с использованием макросов гипотенузы. Хотя 25% от контрольных клеток было свернуто, эта увеличился в 3 раза до 75% в 5 мкМ blebbistatin обработанных клеток отражает ослабление сократительной actinomyosin сети (п = 50 клеток).