Una mejor visualización y análisis cuantitativo de los efectos de drogas Uso de células micropatterned

1. Preparación y la siembra de células en micropatrones Coloque 2 CYTOOchips en dos pozos independientes de una placa de 6 y asegurarse de que usted lea "CYTOO" en la esquina inferior derecha de la CYTOOchip. Micropatrones puede ser marcado con fluorescencia con Cy3 o Cy5 tintes. CYTOOChips utilizados para este experimento se han marcado con fluorescencia Cy3 micropatrones. CUIDADO: Evite que los chips en la oscuridad. Muestras de células HeLa (confluente ~ 80%) por tripsinización. Compruebe con un microscopio que las células están bien dispersos por el tratamiento con tripsina. Recoger y centrifugar las células a 300 g durante 4 minutos, luego suavemente resuspender el botón celular. Recuento de células y se diluye a una concentración de 15.000 células / ml en los medios de cultivo DMEM/F12 completa. Prescindir de 4 ml (60.000 células) en cada pocillo que contiene una CYTOOchip. PRECAUCIÓN: La placa se debe mover lo menos posible para evitar la inducción de los movimientos de rotación en el medio, ya que esto tiende a concentrar las células en el centro. Deje que el sedimento células durante 10 minutos bajo el capó luego pasar a la celda incubadora. Después de 10-20 minutos, las células comienzan a adherirse a la micropatrones. Después de 10 minutos, comprobar con regularidad bajo el microscopio. Tan pronto como las células se ha fijado, cambiar el medio celular y lave cuidadosamente la superficie del cubreobjetos mediante el siguiente procedimiento: Mantener la placa plana, Aspire con cuidado el medio con una pipeta del lado del bien. PRECAUCIÓN: Nunca deje que el chip de secarse, esto significa que no fuera aspirado todo el líquido, pero dejan suficiente para cubrir el CYTOOchip en todo momento. Agregar 4 ml de PBS y aspirar de nuevo se empieza en el centro del chip luego pasar al lado del pozo. Aspirado de la PBS como se describe, sin exponer el chip a la atmósfera. Repita 3-4 veces. Compruebe con el microscopio de las células flotantes: Si un gran número de células flotantes permanecen, repita el procedimiento de lavado. Si usted ve muy pocas células, aspirar a una parte de la PBS y reemplazarlo con 2 ml de medio fresco. Aspirar y añadir 4 ml de medio fresco dos veces. Colocar la placa en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 durante un mínimo de tres horas para permitir que las células para lograr la plena difusión. NOTA: El uso de este método entre un 10-30% (2.000 a 6500) micropatrones será ocupado por una o varias células. PRECAUCIÓN: El tiempo necesario para que las células se adhieran antes de la etapa de lavado y el tiempo necesario para la plena difusión de las células en micropatrones será específico para cada línea celular. 2. Blebbistatin tratamiento Disolver el blebbistatin en el 100% DMSO para obtener una solución stock de 17 mM. Diluir la solución madre de más de 5 mm con 100% de DMSO. Hacer una dilución final en medio de cultivo para obtener una concentración final de blebbistatin M 5 en el 0,1% de DMSO. Para las condiciones de control, preparar 4 ml de medio que contiene 0,1% de DMSO sólo. Aspirar los medios de comunicación en las células y reemplazarlo con el medio de 4 ml preparada para las condiciones de tratamiento y de control. Las células se incuban durante 1 hora a 37 ° C. 3. Fijación y la tinción de células de la actina Preparación de la solución para la fijación de la célula Por favor, consulte la sección de reactivos para la preparación del citoesqueleto de amortiguación (CB) y el 5% de PFA. CB se recomienda especialmente para el etiquetado de fluorescencia de los filamentos de actina y los microtúbulos. Prepare 1xCB-sacarosa: añadir 1 g de sacarosa a 2 ml de CB. La inclusión de sacarosa ayuda a preservar las estructuras internas de la célula. Prepare un 4% PFA-CB-sacarosa: Añadir 1 ml de sacarosa-1xCB a 4 ml de agua tibia PFA 5%. ATENCIÓN: Esta solución puede conservarse a 4 ° C durante unos pocos días. PFA fijación El uso de fórceps para recoger el CYTOOchip en el logotipo de CYTOO y colocarla (sin lavar) en un pocillo de una placa de 6 pocillos con 2 ml de PFA-CB-sacarosa solución al 4% Incubar 10 min a temperatura ambiente Quitar PFA-CB-sacarosa y lavar una vez con PBS Hacer un segundo lavado con 2 ml de 100 mM NH 4 Cl durante 10 minutos con el fin de saciar la actividad residual de entrecruzamiento PFA NOTA: diapositivas PFA fijo puede ser almacenada en PBS durante varios días a 4 ° C antes de la tinción orgánulo de imágenes fluorescentes. Permeabilización de la membrana celular con Triton X-100 Permeabilización de las células con detergente permite anticuerpos o sondas para penetrar la membrana celular y elimina parte de la piscina citosólico de las proteínas del citoesqueleto que de otra manera se puede reducir el contraste de los polímeros del citoesqueleto por lo que es difícil de analizar su localización. Quitar NH 4 Cl y agregar 2 ml / pocillo de 0,1% Triton X-100-CB de 3 min a temperatura ambiente Lavar dos veces con 2 ml de PBS Actina tinción Fluorescentes phalloidin queh une a la actina nativos sólo se utiliza para teñir los filamentos de actina. Añadir 2 ml de FITC-conjugado phalloidin diluido 1:2000 en PBS con 1,5% de BSA Incubar 1 hora a temperatura ambiente Lavar una vez con 2 ml de PBS Los núcleos de tinción Añadir 2 ml de Hoechst (mancha con 1 g / ml en PBS) Incubar tres minutos a temperatura ambiente Lavar dos veces con 2 ml de PBS Montaje de diapositivas Levante el CYTOOchips en el logotipo y CYTOO CYTOOchip montar en un portaobjetos de microscopio estándar con 25-30 l de Mowiol o cualquier otra solución de montaje. 4. Microscopio de instalación y adquisición automática de imagen Numerosos paquetes de software de imágenes existentes que controlan el microscopio en busca de una rápida adquisición de imágenes automatizado y la pantalla. En este ejemplo se utiliza Metamorph software de imágenes y adquisiciones automáticas se realizan en un microscopio Nikon Eclipse Ti equipado con una cámara CCD Hamamatsu y un iluminador Intensilight mercurio contenido en fibra. Las imágenes se adquieren a 20 aumentos en tres longitudes de onda correspondientes a DAPI (núcleos), Cy-3 (micropatrones) y FITC-faloidina (actina). El número de micropatrones visualizado por campo variará dependiendo de las configuraciones de la cámara y el objetivo. Micropatrones CYTOO se colocan a intervalos definidos el uno del otro (100 o 130 m) a través del chip facilitando enormemente la adquisición. Seleccione 20 aumentos Adquisición abierta multidimensionales (en la barra de menú: Aplicaciones / Multidimensional de adquisición) y configurar los distintos parámetros del experimento: Número de longitudes de onda: 3 Tipos de longitud de onda: DAPI, FITC, Cy3 Establecer el tiempo de exposición para cada longitud de onda, en primer lugar se centra en un campo de las células El enfoque automático se puede realizar en cada longitud de onda Seleccionar dónde guardar los datos Seleccione Cy3 longitud de onda y la posición de la cámara de modo que el 12 micropatrones se visualizan y se centra en el campo de la cámara (4 columnas y 3 filas de los patrones). Crear un diario de carreras de adquisición multidimensional. El procedimiento para la creación de una revista se describe en la figura 1. Función de exploración abierta la etapa (en la barra de menús: Dispositivos / Fases / Scan). Para adquirir 24 imágenes cada uno con 12 micropatrones a 20 aumentos, entre 6 columnas y 4 filas con -400 micras de tamaño X paso y 300 micras de tamaño Y paso. En el Diario SET para ejecutar, cargar el MDA.JNL revista. A continuación, pulse Escanear para iniciar la adquisición automática de todo el bloque en las tres longitudes de onda. NOTA: La X e Y tamaño de los pasos aquí indicados pueden variar en función del número de micropatrones presente en un campo de la cámara. Dependiendo de la etapa de creación, dirección en la X y / o Y pueden requerir valores negativos para el movimiento en la dirección correcta. 5. Procesamiento de imágenes y análisis automatizado Muchos paquetes de software de imagen de procesamiento y análisis de existir. Los procedimientos descritos a continuación procesamiento de contorno de la imagen y los pasos de análisis realizada por 2 a medida macros escritas para el programa de código abierto ImageJ. La primera CellRef macro crea una celda de referencia, la hipotenusa segunda rigidez medidas / colapso de la membrana celular. Ambos están disponibles a través del www.cytoo.com . Crear pilas de imágenes de los tres canales se centró en micropatrones (macro CellRef). El uso de células micropatrones evita la agrupación y agrupación, simplificando en gran medida el primer paso en el procesamiento automatizado de imágenes, que es la localización y la segmentación de las células individuales. El marcado con fluorescencia imágenes micropattern se utilizan para definir y delimitar las regiones se centró en la micropatrones. Estas regiones son luego incorporadas a las imágenes adquiridas en otros canales y recortada. Correspondientes imágenes recortadas se ensamblan en pilas para cada longitud de onda. Una pila de RGB, también se crea a partir de la fusión de los tres canales (Figura 2). Aplicar una sola celda de la selección de filtros (macro CellRef) Como se indicó anteriormente, el 10-30% (2,000 a 6,500) de la micropatrones están ocupados por una sola celda o varias celdas, mientras que el resto de micropatrones están vacíos. Para seleccionar las imágenes que muestran micropatrones ocupado por una sola célula, la macro detecta el número de núcleos por la imagen y elimina de todas las pilas (RGB y diferentes longitudes de onda) que contienen más de un núcleo o núcleos no (Figura 3). Eliminar la no normalizada y las células que no son completamente estirada a través de la micropattern con corte de células del área del filtro (macro CellRef) Para eliminar la división de células que han escapado del filtro de núcleos, otro filtro a través del canal FITC para actina se aplica. Área de la celda se calcula y por debajo de un punto de corte determinado (áreas de células alrededor de 2 veces menos que el área de la célula en interfase) se retiran de todas las pilas. El área cubierta celular está determinado por el tamaño del patrón. <li> Alinear imágenes de células (macro CellRef) De los pasos anteriores, las imágenes que contiene solo las células micropatterned fueron seleccionados. A pesar de que estas imágenes se centran en micropatrones, nunca están perfectamente alineados entre sí. Para concluir el procesamiento de imágenes, un plugin de ImageJ (MultiStackReg) se aplica a todas las imágenes recogidas realinear y todos los canales basados ​​en la posición micropattern. Este paso genera pilas alineado de imágenes individuales que se pueden utilizar ahora para el análisis de células individuales o la creación de una celda de referencia (Figura 4) La construcción de una celda de referencia (macro CellRef) Células que crecen en micropatrones significa que todas las células tienen formas similares. Esta normalización permite una orientación precisa y la superposición de imágenes de células muchos. Resumiendo la señal en cada imagen a través de toda la pila permite visualizar y medir un "efecto de la droga promedio". La imagen final general o celda de referencia es una herramienta única y útil para la representación y análisis de imágenes y sólo se puede obtener con células micropatterned (Figura 4). En ImageJ, la celda de referencia se construye haciendo una proyección de las imágenes filtradas y alineado de una pila (Imagen> Pilas> Z-proyecto). Existen varios métodos de proyección se puede aplicar como la intensidad media o máxima, pero por lo general una proyección mediana que se elija lo que elimina los valores extremos principales de la pila de la imagen. Para facilitar el examen de los resultados, una LUT (Look Up Tables) convertir la imagen monocolor en un mapa de frecuencias de colores se aplica. Medición y cuantificación de los parámetros de interés (Hipotenusa macro) En este artículo de vídeo, L-micropatrones se utilizan debido a la forma de organizar el citoesqueleto de actina en una fibra de gran estrés individual. Al poner de relieve la actina de esta manera, el impacto blebbistatin en el citoesqueleto se puede determinar de varias maneras: midiendo los cambios en la curvatura de la fibra de actina estrés, intensidad de la tinción, longitud o el grosor de la fibra de estrés, cambios en las características morfométricas de los filamentos de actina o etc célula forma Estos parámetros se puede medir en las imágenes de células individuales o en la celda de referencia final mismo. En este caso, el impacto de la M blebbistatin 5 se caracteriza por contar el número de células se derrumbó en una segunda macro llamado ImageJ Hipotenusa (Figura 7). En pocas palabras, las imágenes un umbral de la L-micropattern se utilizan para definir una hipotenusa teórico de la forma de triángulo de la célula. A continuación, umbral de las imágenes de actina teñido se realiza con el fin de forma aproximada la célula actual. El área entre la hipotenusa del triángulo teórico celular y la membrana celular real cóncava se mide. Cuando la célula se ha derrumbado, un área por debajo de la hipotenusa teórico aparece. El porcentaje de células se derrumbó se utiliza para comparar el control y tratamiento condiciones. 6. Resultados representante Ejemplos de lo que las células se vería en micropatrones inmediatamente y varias horas después de las etapas de lavado críticos descritos en 1.6-1.8, se muestran en la Figura 5. Después de 15 min en CYTOOchips, ronda las células HeLa se observan a la misma distancia que indica que se han adherido a la micropatrones fibronectina (Figura 5). La adhesión es completa cuando las células permanecen inmovilizados a pesar de agitación suave del recipiente de cultivo. Para reducir al mínimo el número de micropatrones ocupado por varias celdas, los chips luego se lava con PBS para eliminar las células flotando sobre las áreas cytophobic. Después de varias horas, las células que son completamente estirada sobre la micropatrones se verá como los que se muestran en la figura 5b. Típicas imágenes de células individuales obtenidos después de la incubación de células con blebbistatin, la fijación y la tinción de actina y los núcleos se presentan en la Figura 6. Después de la adquisición automática de imágenes múltiples y procesamiento de imágenes mediante el ImageJ CellRef macro, un mapa de frecuencias de colores se genera que representa la intensidad de la actina media de todas las imágenes de células (Figura 6c y 6f). La comparación de la celda de referencia para las condiciones no tratados y tratados demuestra el potencial de este enfoque facilita la observación del fenotipo en estudio y es especialmente útil para explorar los efectos celulares de drogas. Un ejemplo de un posible análisis del efecto de blebbistatin en las células se presenta en la Figura 7. El número de células se derrumbó (es decir, las células con un área en blanco existentes en el marco teórico de la hipotenusa) detectado en 50 células control y células tratadas con 50 mM blebbistatin 5 detectada por el macro Hipotenusa ImageJ se muestra. El aumento del número de células se derrumbó en la población blebbistatin tratados refleja la relajación de las fibras de estrés y por lo tanto la tensión en la membrana debido a la inhibición de las fuerzas blebbistatin actinomyosin contráctil de la célula. Figura 1. Procedimiento para crear una nueva revista con Metamorph. </p> Figura 2. Diagrama de flujo del procedimiento de procesamiento de imágenes automático. Figura 3. Filtrado de células individuales. Figura 4. La construcción de una celda de referencia. Figura 5. Siembra de células. A) las células Hela conforme con micropatrones tras la etapa de lavado (4x) B) Las células HeLa después de la plena difusión de micropatrones L (10 aumentos). Figura 6. Comparación de las células y nonpatterned micropatterned en el control de drogas y las condiciones de tratamiento. Las células HeLa fueron sembradas durante 3 horas y se tratan con blebbistatin 5 M durante 1 hora (panel inferior) o se deja sin tratamiento (panel superior). En el control de las células nonpatterned (a), la actina se ensambla en múltiples fibras que desmontar imperceptiblemente durante el tratamiento con blebbistatin M 5 (d). El L-micropatrones, control de las células adoptan una forma triangular (b) y desarrollar una fibra de actina mayor (fibras de estrés) entre los dos vértices de la L. En comparación con las células nonpatterned (d), blebbistatin induce un gran cambio fenotípico de la L-micropatterned las células (e). Visualización directa de los efectos de drogas y la comparación de control y condiciones que se tratan se pueden visualizar rápidamente con la presentación de la célula de referencia construido a partir de 20 células. Similares a las células individuales, una fibra de estrés intenso y claro está presente en la celda de referencia de control (C), mientras que las células blebbistatin tratados colapso y desaparece la fibra de mayor estrés (f). Figura 7. Ejemplo de un análisis de los efectos de blebbistatin en las células con la hipotenusa macro. Mientras que el 25% del control de las células se derrumbó, este aumento de 3 veces al 75% en los cinco células blebbistatin M tratado que refleja el debilitamiento actinomyosin contráctil de la red (n = 50 células).