Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

1. Preparação de células e propagação em micropadrões Coloque 2 CYTOOchips em 2 poços independente de uma placa de 6 assim garantir que você lê "CYTOO" no canto inferior direito da CYTOOchip. Micropadrões pode ser fluorescente etiquetado com Cy3 Cy5 ou corantes. CYTOOChips utilizado para este experimento tem Cy3 fluorescente etiquetado micropadrões. CUIDADO: Mantenha fichas no escuro. Coletar células HeLa (~ confluentes 80%) por tripsinização. Verificar sob um microscópio que as células são adequadamente dispersas pelo tratamento de tripsina. Coletar e centrifugar células em 300g por 4 min, em seguida, delicadamente ressuspender o pellet celular. Contagem de células e diluir para uma concentração de 15.000 células / mL em meio de cultura completou DMEM/F12. Dispense 4 mL (60.000 células) em cada poço contendo um CYTOOchip. ATENÇÃO: A placa deve ser movido o menos possível para evitar a indução de qualquer movimento de rotação no meio como esse tendem a se concentrar células no centro. Deixe o sedimento de células por 10 minutos sob o capô, em seguida, movê-los para a célula incubadora. Após 10-20 min, as células vão começar a aderir ao micropadrões. Após 10 min, verificar regularmente sob o microscópio. Assim que as células têm ligado, mude o meio celular e lave suavemente a superfície lamela utilizando o seguinte procedimento: Manter a placa plana, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta do lado do bem. CUIDADO: Nunca deixe o chip de fora seca, isso significa que nunca aspirado de fora todo o líquido, mas deixe o suficiente para cobrir o CYTOOchip em todos os momentos. Adicionar 4 mL PBS e aspire novamente a primeira partida no centro do chip, em seguida, mudar-se para o lado do bem. Aspirar fora da PBS, conforme descrito sem expor o chip para o ar. Repita 3-4 vezes. Verifique sob o microscópio para células flutuante: Se um grande número de células permanecem flutuando, repita o procedimento de lavagem. Se você ver muito poucas células, aspirado de parte do PBS e substituí-lo com 2 ml de meio fresco. Aspirar e adicionar 4 mL de meio fresco duas vezes. Coloque a placa em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 para um mínimo de três horas para permitir que as células para alcançar a plena divulgação. NOTA: Usando este método entre 10-30% (2.000-6500) micropadrões será ocupado por uma única célula ou múltiplos. ATENÇÃO: O tempo necessário para que as células aderem antes da etapa de lavagem eo tempo necessário para a plena divulgação de células em micropadrões será específica para cada linhagem celular. 2. Tratamento Blebbistatin Dissolver o blebbistatin em DMSO 100% para obter uma solução estoque de 17 mM. Diluir a solução estoque ainda mais a 5 mM com DMSO 100%. Fazer uma diluição final no meio de cultura para obter uma concentração final de 5 mM em DMSO blebbistatin 0,1%. Para condições de controle, prepare 4 mL de meio contendo DMSO 0,1% apenas. Aspirar a mídia sobre as células e substituí-lo com o meio mL 4 preparado para as condições tratadas e controle. Células incubar por 1 hora a 37 ° C. 3. Fixação de células e coloração de Actina Preparação da solução para a fixação das células Por favor, consulte a secção de reagentes para a preparação do citoesqueleto buffer (CB) e PFA 5%. CB é especialmente recomendado para a rotulagem de fluorescência de filamentos de actina e microtúbulos. Prepare 1xCB sacarose: adicionar 1 g de sacarose a 2 mL da CB. Inclusão de sacarose ajuda a preservar as estruturas celulares internas. Prepare PFA 4% de sacarose-CB: Adicionar 1 mL de 1xCB sacarose para 4 mL de morno PFA 5%. ATENÇÃO: Esta solução pode ser mantido a 4 ° C por alguns dias apenas. Fixação PFA Use uma pinça para pegar o CYTOOchip no logotipo CYTOO e colocá-lo (sem lavar) em um poço de uma placa de 6 poços contendo 2 ml de solução 4% de sacarose PFA-CB- Incubar por 10 min à temperatura ambiente Remover PFA-CB-sacarose e lave uma vez com PBS Fazer uma segunda lavagem com 2 mL de 100 mM NH 4 Cl por 10 min, a fim de saciar a atividade residual crosslinking PFA NOTA: slides PFA fixa podem ser armazenados em PBS durante vários dias a 4 ° C antes organela coloração para imagens fluorescentes. Permeabilização da membrana celular com Triton X-100 Permeabilização das células com detergente permite anticorpos ou outras sondas para penetrar a membrana celular e elimina algumas das piscina citosólico das proteínas do citoesqueleto que podem de alguma forma reduzir o contraste de polímeros do citoesqueleto tornando difícil analisar a sua localização. Remover NH 4 Cl e adicionar 2 mL / poço de 0,1% Triton X-100-CB por 3 min à temperatura ambiente Lave duas vezes com 2 mL de PBS Coloração actina Fluorescente que phalloidinh se liga a actina nativa só é usado para manchar os filamentos de actina. Adicionar 2 mL de FITC-conjugado diluído 1:2000 phalloidin em PBS com BSA 1,5% Incubar 1 hora a RT Lavar uma vez com 2 mL de PBS Coloração núcleos Adicionar 2 mL de Hoechst (mancha com 1μg / mL em PBS) Incubar 3 minutos à temperatura ambiente Lavar 2 vezes com 2 mL de PBS Montagem de slides Pegue o CYTOOchips no logotipo CYTOO e CYTOOchip montagem em uma lâmina de microscópio padrão usando 25-30 mL de Mowiol ou qualquer outra solução de montagem. 4. Setup microscópio e Aquisição de Imagem Automated Numerosos pacotes de software de imagem existem de que o controle do microscópio para aquisição de imagem rápida e automatizada e mostrar. Este exemplo usa Metamorph software de imagem automática e aquisições são realizadas em um microscópio Nikon Eclipse Ti equipado com uma câmera CCD e um Hamamatsu Intensilight iluminador de fibra de mercúrio. Imagens são adquiridas com ampliação de 20x em três comprimentos de onda correspondentes a DAPI (núcleos), Cy-3 (micropadrões) e FITC-faloidina (actina). O número de micropadrões visualizados por campo irá variar dependendo da câmera e configurações objetivo. Micropadrões CYTOO são posicionados em intervalos definidos entre si (100 ou 130 mm) através do chip facilitando bastante a aquisição. Selecione ampliação de 20x Aquisição Multidimensional aberto (na barra de Menu: Apps / Multidimensional Aquisição) e configurar os parâmetros diferentes do experimento: Número de comprimentos de onda: 3 Tipos de comprimento de onda: DAPI, FITC, Cy3 Definir o tempo de exposição para cada comprimento de onda pela primeira foco em um campo de células Autofoco pode ser executada em cada comprimento de onda Selecione onde deseja salvar os dados Selecione Cy3 comprimento de onda e posicionar a câmera de modo que 12 micropadrões são visualizados e centrado no campo da câmara (4 colunas e 3 linhas de padrões). Criar uma revista em execução Aquisição multidimensional. O procedimento para a criação de um jornal é descrito na Figura 1. Função palco aberto Scan (na barra de Menu: Dispositivos / Estágio / Scan Stage). Para adquirir 24 imagens, cada uma contendo 12 micropadrões com ampliação de 20x, entre 6 colunas e 4 linhas com -400 M X tamanho do passo e 300 mm, tamanho do passo Y. No Jornal SET para executar, fazer o upload do MDA.JNL revista. Em seguida, pressione Digitalizar para iniciar a aquisição automatizada de todo o bloco nos três comprimentos de onda. NOTA: O X e Y tamanhos passo aqui indicado variará de acordo com o número de micropadrões presentes em um campo de câmera. Dependendo do seu palco montado, na direção X e / ou Y pode exigir valores negativos para o movimento na direção correta. 5. Processamento de Imagem e Análise automatizada Muitos pacotes de software de imagem de processamento e análise de existir. Os procedimentos descritos abaixo processamento de contorno da imagem e as etapas de análise realizada por 2 custom-made macros escritas para o open source programa ImageJ. O CellRef macro primeiro cria uma célula de referência, o segundo Hypotenuse medidas rigidez colapso / da membrana celular. Ambos estão disponíveis mediante solicitação através www.cytoo.com . Criar pilhas de imagens para todos os três canais centrados em micropadrões (macro CellRef). Uso de células micropadrões evita agrupamento e agregação, simplificando enormemente o primeiro passo no processamento de imagem que é automatizado de localização e de segmentação de células individuais. As imagens fluorescente etiquetado micropattern são usados ​​para definir e delimitar as regiões centrado na micropadrões. Estas regiões são então transpostos para as imagens adquiridas em outros canais e cortadas. Correspondente imagens cortadas são então reunidos em pilhas para cada comprimento de onda. A RGB-pilha é também criada a partir da fusão dos três canais (Figura 2). Aplicar única célula de seleção de filtro (macro CellRef) Como indicado acima, 10-30% (2.000-6.500) da micropadrões são ocupados por uma única célula ou várias células, enquanto o micropadrões restantes estão vazios. Para selecionar as imagens que mostram micropadrões ocupado por apenas uma única célula, a macro detecta o número de núcleos por imagem e elimina de todos (RGB e diferentes comprimentos de onda) pilhas que contenham mais de um núcleo ou não núcleos (Figura 3). Eliminar a não-normalizada e células que não são totalmente esticado em todo o micropattern usando cut-off área da célula de filtro (macro CellRef) Para remover células em divisão que teria escapado o filtro núcleos, outro filtro através do canal de FITC para actina é aplicada. Área da célula é calculado e aqueles abaixo de um off cortar certas (áreas de células cerca de 2 vezes menos de área celular interfase) são removidas todas as pilhas. A área envelope célula é determinada pelo tamanho do padrão. <li> Alinhar imagens das células (macro CellRef) Das etapas anteriores, as imagens que contenham células único micropatterned foram selecionados. Mesmo que essas imagens estão centradas na micropadrões, eles nunca estão todos perfeitamente alinhados uns aos outros. Para concluir o processamento de imagem, um plugin ImageJ (MultiStackReg) é aplicada para realinhar todas as imagens recolhidas e todos os canais com base na posição micropattern. Esta etapa gera pilhas alinhado de imagens individuais que agora pode ser usado para a análise única célula ou a criação de uma célula de referência (Figura 4) Construção de uma célula de referência (macro CellRef) Células que crescem em micropadrões significa que todas as células têm formas semelhantes. Esta normalização permite um alinhamento preciso e sobreposição de imagens de células muitos. Resumindo o sinal em cada imagem sobre a pilha inteira permite visualizar e medir um "efeito de drogas média". A imagem final global ou célula de referência é uma ferramenta única e útil para a representação e análise de imagem e só pode ser obtido com células micropatterned (Figura 4). No ImageJ, a célula de referência é construída, fazendo uma projeção das imagens filtradas e alinhada a partir de uma pilha (Image> Pilhas> Z-projeto). Vários métodos de projeção pode ser aplicado como a intensidade média ou máxima, mas geralmente uma projeção mediana é escolhido o que elimina outliers principal da pilha de imagens. Para facilitar a análise dos resultados, uma LUT (Look Up Tables) converter a imagem monocolor em um mapa de freqüência com código de cores é aplicado. Medir e quantificar os parâmetros de interesse (Hypotenuse macro) Neste artigo de vídeo, L-micropadrões são utilizadas porque a forma organiza o citoesqueleto de actina em uma fibra única grande estresse. Destacando actina, desta forma, o impacto blebbistatin sobre o citoesqueleto pode ser determinada de várias maneiras: medir as mudanças na curvatura da fibra estresse actina, coloração intensidade, duração ou a espessura da fibra stress, alterações nas características morfométricas dos filamentos de actina ou etc forma da célula Estes parâmetros podem ser medidos tanto em imagens de células individuais ou na célula de referência final em si. Aqui, o impacto de 5 blebbistatin mM foi caracterizado pela contagem do número de células usando um segundo colapso ImageJ macro chamado hipotenusa (Figura 7). Resumidamente, imagens thresholded da L-micropattern são usados ​​para definir uma hipotenusa teóricas da forma de triângulo celular. Em seguida, limiarização das imagens manchadas de actina é realizada, a fim de aproximar a forma da célula real. A área entre a hipotenusa do triângulo teórico celular e da membrana da célula real côncavo é, então, medido. Quando a célula entrou em colapso, uma área sob a hipotenusa teórica aparece. A porcentagem de células colapso é usado para comparar o controle e tratados condições. 6. Resultados representante Exemplos do que deve ser semelhante a células em micropadrões imediatamente e várias horas após as etapas de lavagem críticas descritas nos 1,6-1,8, são mostrados na Figura 5. Depois de 15 min em CYTOOchips, células redondas HeLa são observados a distâncias iguais, indicando que eles aderiram ao micropadrões fibronectina (Figura 5a). Adesão é completa quando as células permanecem imobilizados apesar agitação suave do recipiente de cultura. Para minimizar o número de micropadrões ocupada por várias células, os chips são então lavados com PBS para remover as células flutuando sobre as áreas cytophobic. Depois de várias horas, as células que são totalmente esticada sobre a micropadrões vai olhar como os mostrados na Figura 5b. Imagens típicas única célula obtida após incubação de células com fixação blebbistatin, e coloração de actina e núcleos são apresentados na Figura 6. Após a aquisição automatizada de várias imagens e processamento de imagens usando o ImageJ CellRef macro, um mapa de freqüência com código de cores é gerado, que retrata a intensidade da actina, calculados sobre todas as imagens de células (Figura 6c e 6f). A comparação da Célula de Referência para as condições não tratadas e tratadas mostra o potencial dessa abordagem para fácil observação do fenótipo em estudo e é especialmente útil para explorar os efeitos da droga celular. Um exemplo de uma possível análise do efeito da blebbistatin nas células é apresentado na Figura 7. O número de células fechada (ou seja, células com uma área em branco existentes sob a hipotenusa teórica) detectados em 50 células controle e 50 células tratadas com 5 mM blebbistatin detectado pelo macro Hypotenuse ImageJ é mostrado. O aumento do número de células colapso na população blebbistatin tratados reflete o relaxamento das fibras de estresse e, portanto, a tensão na membrana devido à inibição das forças blebbistatin actinomyosin contrátil dentro da célula. Figura 1. Procedimento para criar uma nova revista com Metamorph. </p> Figura Fluxograma 2. Automática do procedimento de processamento de imagem. Figura 3. Filtering para fora das células individuais. Figura 4. A construção de uma célula de referência. Figura 5. Semeadura Cell. A) células Hela adere a micropadrões após a etapa de lavagem (ampliação 4x) B) células HeLa após a completa divulgação sobre micropadrões L (10x). Figura 6. Comparação de células nonpatterned e micropatterned no controle e condições de drogas tratados. Células HeLa foram semeadas durante 3 horas e tratados com 5 blebbistatin M para uma hora (painel inferior) ou não tratada (superior do painel). Em células controle nonpatterned (a), actina monta em fibras múltiplas que desmontar imperceptível sobre o tratamento com 5 blebbistatin mM (d). Em L-micropadrões, células controle adotar uma forma triangular (b) e desenvolver uma fibra de actina major (fibras de stress) entre os dois ápices da L. Comparado com células nonpatterned (d), blebbistatin induz uma grande mudança fenotípica em L-micropatterned células (e). Visualização direta dos efeitos de drogas ea comparação de controle e condições tratadas podem ser visualizadas rapidamente com a apresentação célula de referência construída a partir de 20 células. Semelhantes às células individuais, uma fibra estresse clara e intensa está presente na célula de referência de controle (c), enquanto blebbistatin células tratadas com o colapso ea fibra de estresse desaparece (f). Figura 7. Exemplo de uma análise dos efeitos da blebbistatin sobre as células usando a hipotenusa macro. Enquanto 25% das células controle foram desabou, esta aumentou 3 vezes e 75% na 5 células M blebbistatin tratados refletindo o enfraquecimento actinomyosin contrátil rede (n = 50 células).