Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов
Summary
Этот протокол описывает шаги, необходимые для расчленения, трансфекции с помощью электропорации и культуры гиппокампа мышей и корковые нейроны. Краткосрочные культуры могут быть использованы для изучения результатом аксонов и руководства, в то время как долгосрочные культуры могут быть использованы для изучения синаптогенез и дендритные анализ позвоночника.
Abstract
Гиппокампа и коры нейроны широко используются для изучения центральной нервной системы (ЦНС) нейронов поляризации, аксон / дендритов результат, формирования синапсов и функции. Преимущество культивирования этих нейронов является то, что они с готовностью поляризации, формируя отличительные аксонов и дендритов, на двумерной подложке при очень низкой плотности. Это свойство делает их чрезвычайно полезными для определения многих аспектов развития нейронов. Кроме того, путем предоставления глиальных кондиционирования для этих нейронов они будут продолжать развиваться, образуя функциональные синаптических связей и выжить в течение нескольких месяцев в культуре. В этом протоколе мы опишем технику до расчленения, культуры и трансфекции эмбриональных мыши гиппокампа и коры нейроны. Трансфекция осуществляется electroporating ДНК в нейронах перед покрытием через nucleofection. Этот протокол имеет то преимущество, выразив флуоресцентно с метками слитые белки на ранних стадиях развития (~ 4-8 часов после покрытия) для изучения динамики и функции белков в процессе поляризации, результатом аксонов и ветвления. Мы также обнаружили, что этот единственный трансфекции до покрытие сохраняет флуоресцентно-выражение-метку гибридный белок на уровнях, соответствующих для работы с изображениями в течение всей жизни нейрона (> 2-х месяцев в культуре). Таким образом, данная методика полезна для изучения локализации белка и функции на протяжении развития ЦНС практически без нарушения функции нейронов.
Protocol
Discussion
Этот протокол для культивирования эмбриональных гиппокампа и коры нейроны мыши был разработан как модификация Banker протокол, который использует 1,2 крысы нейроны. Мы использовали этот протокол для мыши культивирования и хомяк нейронах, а 3,4,5,6,7. Этот протокол работает одинаково хорошо как для гиппокампа и неокортекса нейронов и похож на протокол опубликован Meberg и Миллер 8. Как правило, мы используем нейронов гиппокампа для долгосрочного культуры, потому что они хорошо описаны и более устоявшиеся модели системы. Кроме того, они, вероятно, содержат более однородным населением нейронов, чем неокортекса. Тем не менее, нейроны неокортекса культурный используя этот протокол также выжить и дифференцировать аналогично (неопубликованные данные). Мы регулярно использовать гиппокампа и неокортекса нейронов за короткий срок культуры. Препарирование коры головного мозга также приводит к существенно более нейронов (нейронов 1.5×10 6 на каждую пару коры), чем гиппокампа рассечение (2.5×10 5 нейронов в гиппокампе пара), что делает его лучшим выбором материала для западных промокательной, например.
Как и с любой первичной культуре, важно, чтобы свести к минимуму время, которое требуется от смерти животного покрытие клеток. Это обычно занимает 10-20 вскрытия стать последовательно быстро на вскрытие и обшивки. Кроме того, при работе с Lonza Nucleofector, очень важно работать быстро при электропорации процедуры, как жизнеспособность нейронов быстро уменьшается, если они остаются в nucleofection буфера.
Большая часть наших изображений ведется с микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRFM). Этот тип микроскопа способна только изображения нескольких сотен нанометров за пределы покровного стекла. Таким образом, области нейроны, которые мы часто изображения, аксонального конуса роста и дендритных шипиков, должны быть соблюдены прямо на покровное. Таким образом, мы используем низкой плотности культур, которые требуют глиальных питания для долгосрочных культуры. Мы использовали выше плотность культур (> 2х10 4 клеток / см 2), без глиальных слоев подачи, для долгосрочных культур и обнаружил, что они выживают очень хорошо с маленькой грудью. Тем не менее, дендритных шипиков этих нейронов являются зачастую слишком далеко от подложки к изображению в TIRFM, хотя они могут быть легко обнаружены с широким полем зрения микроскопа или конфокальной микроскопии.
В большинстве наших исследований мы трансфекции нейронов до обшивки, и отображаемого флуоресцентно-меченых белков на срок до трех месяцев в культуре. Этот долгосрочный выражение флуоресцентно-меченых белков дает нам уверенность, что при использовании низких концентраций ДНК (1-2μg), мы не производим гиперэкспрессия артефакты в нейронах. Однако, эта процедура также может быть использован для изучения экспрессии белков, если большое количество ДНК используются (10-20 мкг). Плазмиды, которые мы используем для трансфекции нейроны обычно содержат белки EGFP или mCherry фьюжн, хотя мы также этикетки с цитоплазме нейронов DsRed2 или EGFP в одиночку. Это электропорации техника хорошо работает с рядом векторов. Мы предпочитаем плазмиды, которые содержат β-актин промотора CMV усилитель и β-глобина поли-хвост (или pCAGGs pCAX плазмид) 9, в связи с относительно высоким уровнем экспрессии, а также тот факт, что они хорошо переносятся нейронов как в кратко-и долгосрочных культуры. Как правило, белки начинают выражать в течение примерно 4 часов покрытия и достичь уровня достаточного для работы с изображениями в 10-24 часа 10. Мы успешно использовали CMV-промотор-приводом плазмид в короткий срок культур, но обнаружили, что они могут привести к высокому уровню гиперэкспрессия, которые убивают нейроны в долгосрочной культуры. Тем не менее, мы обнаружили, что глиальные кондиционирования низкой плотности культур помогает выживанию нейронов трансфицированных CMV-промотора приводом плазмиды, по сравнению с более высокой плотностью (не глиальных кормили) культур.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Все процедуры были одобрены Университета Висконсина комитета по уходу за животными и были в соответствии с руководящими принципами NIH. Мы благодарим доктора Кэтрин Калил за щедрое использование ее Nucleofector устройства. Мы также благодарим членов Дент лабораторию для комментариев по протоколу. Эта работа была поддержана грантами NIH R01-NS064014, Дана фонд и Фонд Уайтхолл EWD
Кристофер Viesselmann, Джейсон Ballweg и Дерек Lumbard способствовали в равной степени к этой статье.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium Borate | Fisher | S93356 | Store borate buffer at room temperature (RT). | |
| Poly-d-Lysine | Sigma | P7886-100mg | Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C. | |
| Trypsin (10x) | Invitrogen | 15090-046 | Store aliquots at -80°C. | |
| DNase (10x) | Sigma | DN25-1G | Store aliquots at -80°C. | |
| MEM | Invitrogen | 11095-080 | Store at 4°C. | |
| HBSS (10x) | Invitrogen | 14185-052 | Store at RT. | |
| HEPES (100x) | Invitrogen | 15630-080 | Store at 4°C. | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Invitrogen | 15140-122 | Store aliquots at -80°C. | |
| Horse Serum | Hyclone | SH3007403 | Store aliquots at -80°C. | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | Store at 4°C. | |
| Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | Store at 4°C. | |
| B27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | Store aliquots at -80°C. | |
| Glutamine (100x) | Invitrogen | 25030-081 | Store aliquots at -80°C | |
| 30% Glucose in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP350-500 | Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
| 3.75M NaCl in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP358-1 | Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH3007003 | Store aliquots at -80°C. | |
| Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w) | Fisher | Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1 | Combine in conical tube and melt in boiling water. | |
| Concentrated Nitric Acid (HNO3) | Fisher | A509-212 | Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows. | |
| 5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X) | Sigma | C6645 | Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C |
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.
References
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. Chapter 13. Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
- Dent, E. W., Kalil, K. Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton. Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).
- Dent, E. W. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).
- Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).
- Lebrand, C. Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1. Neuron. 42, 37-49 (2004).
- Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Chapter 7. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Zeitelhofer, M. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
