Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.
Hippokampalen und kortikalen Neuronen wurden ausgiebig auf das zentrale Nervensystem (ZNS) neuronalen Polarisation, Axon / Dendriten Auswuchs, und Synapsenbildung und Funktion Studie verwendet. Ein Vorteil der Kultivierung dieser Neuronen ist, dass sie leicht zu polarisieren, bilden markante Axonen und Dendriten, auf einer zweidimensionalen Substrat bei sehr geringen Dichten. Diese Eigenschaft hat sie extrem nützlich für die Bestimmung viele Aspekte der neuronalen Entwicklung. Darüber hinaus, indem sie Gliazellen Klimaanlage für diese Neuronen werden sie weiter zu entwickeln, bilden funktionelle synaptische Verbindungen und Überleben für einige Monate in Kultur. In diesem Protokoll skizzieren wir eine Technik zu sezieren, Kultur und Transfektion von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen. Die Transfektion wird durch Elektroporation von DNA in die Neuronen vor dem Ausplattieren über Nukleofektion erreicht. Dieses Protokoll hat den Vorteil, auszudrücken Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine früh in der Entwicklung (~ 4-8h nach dem Ausplattieren), um die Dynamik und Funktion von Proteinen während der Polarisation, Axon Auswuchs und Verzweigung zu studieren. Wir haben auch entdeckt, dass diese einzelne Transfektion vor dem Ausplattieren Fluoreszenz-markierten Fusionsproteins Ausdruck unterhält auf einem Niveau angemessen für die Bildgebung während der gesamten Lebensdauer des Neurons (> 2 Monate in Kultur). Somit ist diese Methode zur Untersuchung von Protein-Lokalisation und Funktion im gesamten ZNS-Entwicklung mit wenig oder gar keine Störung der neuronalen Funktion.
Dieses Protokoll zur Kultivierung von embryonalen hippokampalen und kortikalen Neuronen der Maus wurde als eine Modifikation der Banker-Protokoll, das Rattenneuronen 1,2 verwendet entwickelt. Wir haben dieses Protokoll zur Kultivierung von Maus und Hamster Neuronen verwendet sowie 3,4,5,6,7. Dieses Protokoll funktioniert genauso gut für beide Hippocampus und Neokortex Neuronen und ist vergleichbar mit einem Protokoll, das von Meberg und Miller 8 veröffentlicht. Generell verwenden wir Hippocampus-Neuronen für die langfristige Kultur, weil sie gut charakterisiert sind und ein etabliertes Modell-System. Darüber hinaus sind sie wahrscheinlich zu einer homogenen Population von Neuronen als Neocortex enthalten. Allerdings kultivierten Neuronen Neokortex mit diesem Protokoll auch überleben und differenzieren ähnlich (unveröffentlichte Daten). Wir verwenden routinemäßig Hippocampus und Neokortex Neuronen für kurzfristige Kultur. Präparation des Neokortex führt auch zu wesentlich mehr Neuronen (1.5×10 6 Neuronen pro Paar Kortex) als Hippocampus Dissektion (2.5×10 5 Neuronen pro Paar hippocampi), das es eine bessere Auswahl des Materials für Western-Blot, zum Beispiel macht.
Wie bei allen primären Kultur, ist es wichtig, die Zeit, die vom Tod des Tieres, um die Plattierung der Zellen zu minimieren. Es dauert in der Regel 10-20 Dissektionen zu werden konstant schnell zu Dissektion und Beschichtung. Auch beim Arbeiten mit der Lonza Nucleofector, ist es wichtig, schnell zu arbeiten während der Elektroporation Verfahren, wie die Lebensfähigkeit der Nervenzellen schnell abnimmt, wenn sie in der Nukleofektion Puffer übrig sind.
Ein Großteil unserer Bildgebung ist mit einem inneren Reflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) durchgeführt. Diese Art der Mikroskopie ist nur in der Lage Bildgebung mehreren hundert Nanometern über dem Deckglas. Daher werden die Bereiche der Neuronen, die wir häufig image, müssen die axonale Wachstum Kegel und dendritischen Dornen, direkt an das Deckglas eingehalten werden. So verwenden wir low density Kulturen, die Gliazellen Fütterung benötigen für die langfristige Kultur. Wir haben eine höhere Dichte Kulturen eingesetzt (> 2×10 4 Zellen / cm 2), ohne Gliazellen Feeder Schichten, für die langfristige Kulturen und festgestellt, dass sie sehr gut überleben mit wenig füttern. Allerdings sind die dendritischen Dornen dieser Neurone oft zu weit weg vom Substrat zum Bild in TIRFM, obwohl sie leicht mit Weitwinkel-Mikroskopie oder der konfokalen Mikroskopie nachgewiesen werden.
In den meisten unserer Studien haben wir transfizieren Neuronen vor dem Ausplattieren und abgebildet fluoreszenzmarkierten Proteine für bis zu drei Monate in Kultur. Diese langfristige Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen gibt uns die Zuversicht, dass durch niedrige Konzentrationen von DNA (1-2μg) sind wir nicht produzieren Überexpression Artefakte in den Neuronen. Allerdings kann dieses Verfahren auch zur Überexpression von Proteinen untersucht werden, ob große Mengen von DNA verwendet werden (10-20mg) werden. Die Plasmide, die wir verwenden, um Neuronen transfizieren enthalten in der Regel EGFP oder mCherry Fusionsproteine, obwohl wir auch Label das neuronale Zytoplasma mit DsRed2 oder EGFP allein. Diese Elektroporation Technik funktioniert gut mit einer Reihe von Vektoren. Wir bevorzugen Plasmide, die eine β-Aktin-Promotor mit einer CMV-Enhancer und β-Globin enthalten poly-A-Schwanz (pCAGGs oder pCAX Plasmide) 9, aufgrund der relativ hohen Niveau des Ausdrucks, und die Tatsache, dass sie gut von den Neuronen geduldet in kurz-und langfristige Kultur. Im Allgemeinen beginnt Proteine innerhalb von ca. 4 Stunden plating auszudrücken und erreichen Werte ausreichend für die Bildgebung in 10-24h 10. Wir haben erfolgreich CMV-Promotor getriebene Plasmide in kurzfristige Kulturen verwendet, haben aber festgestellt, dass sie ein hohes Maß an Überexpression dazu führen, dass zu töten Nervenzellen in langfristige Kultur. Trotzdem haben wir festgestellt, dass die Gliazellen Konditionierung von low density Kulturen mit dem Überleben von Neuronen mit CMV-Promotor angetrieben Plasmiden transfiziert hilft, im Vergleich zu höheren Dichte (non-Glia-fed) Kulturen.
The authors have nothing to disclose.
Alle Verfahren wurden von der University of Wisconsin Ausschuss für Animal Care genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien. Wir danken Dr. Katherine Kalil für die großzügige Verwendung von ihr Nucleofector Gerät. Wir danken auch Mitglieder der Dent Labor für Kommentare zu Protokoll. Diese Arbeit wurde durch Stipendien NIH R01-NS064014, Dana Foundation und Whitehall Stiftung EWD unterstützt
Christopher Viesselmann, Jason Ballweg und Derek Lumbard trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Sodium Borate | Fisher | S93356 | Store borate buffer at room temperature (RT). | |
Poly-d-Lysine | Sigma | P7886-100mg | Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C. | |
Trypsin (10x) | Invitrogen | 15090-046 | Store aliquots at -80°C. | |
DNase (10x) | Sigma | DN25-1G | Store aliquots at -80°C. | |
MEM | Invitrogen | 11095-080 | Store at 4°C. | |
HBSS (10x) | Invitrogen | 14185-052 | Store at RT. | |
HEPES (100x) | Invitrogen | 15630-080 | Store at 4°C. | |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Invitrogen | 15140-122 | Store aliquots at -80°C. | |
Horse Serum | Hyclone | SH3007403 | Store aliquots at -80°C. | |
Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | Store at 4°C. | |
Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | Store at 4°C. | |
B27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | Store aliquots at -80°C. | |
Glutamine (100x) | Invitrogen | 25030-081 | Store aliquots at -80°C | |
30% Glucose in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP350-500 | Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
3.75M NaCl in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP358-1 | Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH3007003 | Store aliquots at -80°C. | |
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w) | Fisher | Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1 | Combine in conical tube and melt in boiling water. | |
Concentrated Nitric Acid (HNO3) | Fisher | A509-212 | Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows. | |
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X) | Sigma | C6645 | Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C |
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.