Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية
Summary
هذا البروتوكول يحدد الخطوات المطلوبة لتشريح ، transfect electroporation عبر الماوس والخلايا العصبية قرن آمون والثقافة القشرية. يمكن استخدامها على المدى القصير للدراسات الثقافات ثمرة محوار والتوجيه ، في حين يمكن استخدامها على المدى الطويل للدراسات الثقافات synaptogenesis وتحليل شجيري العمود الفقري.
Abstract
وقد استخدمت الخلايا العصبية قرن آمون والقشرية على نطاق واسع لدراسة الجهاز العصبي المركزي (CNS) الاستقطاب العصبية ، ثمرة محوار / تغصن ، وتشكيل المشبك وظيفة. ميزة هذه استنبات الخلايا العصبية هي أنها استقطاب بسهولة ، وتشكيل المحاور المميزة والتشعبات ، على ركيزة ثنائية الأبعاد في كثافة منخفضة جدا. وقد جعلت هذه الخاصية مفيدة جدا لهم لتحديد العديد من جوانب التنمية العصبية. علاوة على ذلك ، من خلال توفير تكييف الدبقية لهذه الخلايا العصبية فإنها تستمر في تطوير وتشكيل اتصالات متشابك وظيفية والباقين على قيد الحياة لعدة أشهر في الثقافة. نحن في هذا البروتوكول مخطط تقنية لتشريح والثقافة وtransfect الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية. ويتم إنجاز ترنسفكأيشن electroporating بواسطة الحمض النووي في الخلايا العصبية قبل الطلاء عبر nucleofection. هذا البروتوكول لديه ميزة للتعبير عن البروتينات الانصهار fluorescently الموسومة في وقت مبكر في عملية التنمية (~ 4 – 8hrs بعد الطلاء) لدراسة ديناميات وظيفة من البروتينات خلال ثمرة الاستقطاب المحور ، والمتفرعة. اكتشفنا ايضا ان هذا ترنسفكأيشن واحد قبل الطلاء يحافظ fluorescently الموسومة بروتين تعبير الانصهار عند مستويات مناسبة للتصوير طوال مدة الخلايا العصبية (> 2 أشهر في الثقافة). وبالتالي ، فإن هذه المنهجية هي مفيدة لدراسة توطين وظيفة البروتين في جميع أنحاء التنمية اضطراب الجهاز العصبي المركزي مع ضئيلة أو معدومة في وظيفة الخلايا العصبية.
Protocol
Discussion
وقد تم تطوير هذا البروتوكول من أجل استنبات الخلايا العصبية الجنينية الماوس قرن آمون والقشرة وتعديل البروتوكول بانكر ، التي تستخدم الخلايا العصبية الفئران 1،2. وقد استخدمنا هذا البروتوكول للماوس وزراعة الخلايا العصبية كما الهامستر 3،4،5،6،7 جيدا. هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد على قدم المساواة كل من الخلايا العصبية للقرن آمون والقشرة المخية الحديثة ومشابه لبروتوكول نشرتها Meberg وميلر 8. عموما ، نحن نستخدم الخلايا العصبية الحصين على المدى الطويل لأن ثقافة تتميز أيضا أنها نموذج ونظام أكثر رسوخا. علاوة على ذلك ، من المرجح أن تحتوي على مجموعة من السكان أكثر تجانسا من الخلايا العصبية من القشرة المخية الحديثة. ومع ذلك ، الخلايا العصبية مثقف القشرة المخية الحديثة باستخدام هذا البروتوكول أيضا البقاء على قيد الحياة والتفريق بالمثل (بيانات غير منشورة). نستخدم عادة الخلايا العصبية قرن آمون والقشرة المخية الحديثة للثقافة على المدى القصير. نتائج تشريح القشرة المخية الحديثة أيضا في الخلايا العصبية أكثر بكثير (1.5×10 6 الخلايا العصبية لكل زوج من القشور) من تشريح الحصين (2.5×10 5 الخلايا العصبية لكل زوج من الحصين) ، مما يجعله خيارا أفضل المواد لالنشاف الغربية ، على سبيل المثال.
كما هو الحال مع أي ثقافة الأولية ، فإنه من الضروري لتقليل الوقت الذي يستغرقه من موت الحيوان إلى طلاء للخلايا. وسوف يستغرق عادة 10-20 تشريح لتصبح سريع باستمرار في تشريح والطلاء. أيضا ، عند العمل مع Nucleofector Lonza ، من الأهمية بمكان العمل بسرعة أثناء إجراء electroporation ، وبقاء الخلايا العصبية يتناقص بسرعة إذا ما تركت في المنطقة العازلة nucleofection.
ويجري تصوير الكثير من علاقاتنا مع الانعكاس الداخلي الكلي المجهري مضان (TIRFM). هذا النوع من الفحص المجهري هي الوحيدة القادرة على عدة مئات من نانومتر التصوير خارج ساترة. ولذلك ، فإن مناطق الخلايا العصبية التي كثيرا ما كنا الصورة ، مخروط النمو محواري والعمود الفقري شجيري ، والحاجة إلى التقيد مباشرة إلى ساترة. وبالتالي ، فإننا نستخدم الثقافات منخفض الكثافة التي تتطلب تغذية الدبقية لمدة طويلة الأجل الثقافة. وقد استخدمنا الثقافات العالي الكثافة (> 2×10 4 خلايا / سم 2) ، من دون طبقات المغذية الدبقية ، على المدى الطويل الثقافات وجدت أنها البقاء على قيد الحياة بشكل جيد جدا مع قليل التغذية. ومع ذلك ، العمود الفقري شجيري من هذه الخلايا العصبية هي في كثير من الأحيان بعيدا جدا من الركيزة لصورة في TIRFM ، على الرغم من أنها يمكن الكشف عنها بسهولة مع واسعة المجال المجهري أو المجهري متحد البؤر.
في معظم الدراسات لدينا نحن transfect الخلايا العصبية قبل الطلاء ، ولقد التقط fluorescently البروتينات التي تحمل علامات لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر في مجال الثقافة. هذا التعبير على المدى الطويل من البروتينات التي تحمل علامات fluorescently يعطينا الثقة بأن باستخدام تركيزات منخفضة من الحمض النووي (1 – 2μg) ونحن لا تنتج القطع الأثرية overexpression في الخلايا العصبية. ومع ذلك ، يمكن أيضا أن تستخدم هذا الإجراء لدراسة overexpression من البروتينات إذا تم استخدام كميات كبيرة من الحمض النووي (10 20μg). والبلازميدات التي نستخدمها لtransfect الخلايا العصبية عادة ما تحتوي على البروتينات أو الانصهار EGFP mCherry ، على الرغم من أننا أيضا تسمية السيتوبلازم العصبية مع DsRed2 أو EGFP وحدها. هذه التقنية تعمل بشكل جيد electroporation مع عدد من النواقل. نحن نفضل البلازميدات التي تحتوي على مروج β – أكتين مع محسن CMV وβ غلوبين بولي – A الذيل (pCAGGs أو البلازميدات pCAX) 9 ، ويرجع ذلك الى مستويات عالية نسبيا من التعبير ، والحقيقة التي تحملها جيدا من قبل الخلايا العصبية في كل ثقافة قصيرة الأجل وطويلة الأجل. عموما ، تبدأ في التعبير عن البروتينات داخل نحو 4 ساعات من الطلاء والوصول إلى مستويات كافية للتصوير في غضون 10 – 10 24hrs. وقد استخدمنا بنجاح CMV – المروج يحركها البلازميدات في الثقافات المدى القصير ، ولكن وجدت أنها يمكن أن تسبب مستويات عالية من overexpression التي تقتل الخلايا العصبية في المدى الطويل الثقافة. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن تكييف الدبقية الثقافات منخفض الكثافة يساعد على بقاء الخلايا العصبية مع transfected CMV – المروج البلازميدات مدفوعة ، مقارنة مع ارتفاع الكثافة (غير الدبقية فدان) الثقافات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد وافق جميع الإجراءات المتبعة في جامعة ولاية ويسكونسن على لجنة رعاية الحيوان ، وكانت متفقة مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة. نشكر الدكتور كاثرين قليل قرب نابلس لاستخدام الجهاز سخية لها Nucleofector. ونشكر أيضا أعضاء في مختبر دنت للتعليق على هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 – NS064014 ، ومؤسسة دانا وايتهول لمؤسسة EWD
ساهم Viesselmann كريستوفر ، وجايسون Ballweg Lumbard ديريك بالتساوي على هذه الورقة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium Borate | Fisher | S93356 | Store borate buffer at room temperature (RT). | |
| Poly-d-Lysine | Sigma | P7886-100mg | Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C. | |
| Trypsin (10x) | Invitrogen | 15090-046 | Store aliquots at -80°C. | |
| DNase (10x) | Sigma | DN25-1G | Store aliquots at -80°C. | |
| MEM | Invitrogen | 11095-080 | Store at 4°C. | |
| HBSS (10x) | Invitrogen | 14185-052 | Store at RT. | |
| HEPES (100x) | Invitrogen | 15630-080 | Store at 4°C. | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Invitrogen | 15140-122 | Store aliquots at -80°C. | |
| Horse Serum | Hyclone | SH3007403 | Store aliquots at -80°C. | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | Store at 4°C. | |
| Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | Store at 4°C. | |
| B27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | Store aliquots at -80°C. | |
| Glutamine (100x) | Invitrogen | 25030-081 | Store aliquots at -80°C | |
| 30% Glucose in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP350-500 | Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
| 3.75M NaCl in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP358-1 | Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH3007003 | Store aliquots at -80°C. | |
| Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w) | Fisher | Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1 | Combine in conical tube and melt in boiling water. | |
| Concentrated Nitric Acid (HNO3) | Fisher | A509-212 | Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows. | |
| 5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X) | Sigma | C6645 | Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C |
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.
References
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. Chapter 13. Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
- Dent, E. W., Kalil, K. Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton. Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).
- Dent, E. W. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).
- Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).
- Lebrand, C. Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1. Neuron. 42, 37-49 (2004).
- Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Chapter 7. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Zeitelhofer, M. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
