Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

1. Preparación de cubreobjetos y Cámaras Preparación de cubreobjetos limpio y las cámaras es esencial para las culturas saludables. Los accesos directos no se debe tomar en cualquiera de estos pasos. Lave el cubreobjetos (12 mm o 22 mm redondo, vidrio alemán – Carolina Marca auxiliar) durante la noche en ácido nítrico concentrado (HNO3) en un frasco de vidrio dedicado o un vaso. Quitar los cubreobjetos de ácido nítrico y lavar ampliamente (5-7x) en agua destilada. Separar el cubreobjetos y seca en una campana de flujo laminar o gabinete de bioseguridad. Una vez seco, esterilizarlos con luz UV durante 30 minutos. Lugar esterilizados cubreobjetos en placas de Petri estéril para su almacenamiento. Si las neuronas chapado en cubreobjetos de 12 mm directamente lugar cubreobjetos en una placa de 35 mm estériles y proceder a la Sección 2. Cámaras de imágenes están construidas mediante la perforación de un agujero de 15 mm en la parte inferior de 35 mm placas de Petri (eliminar todas las rebabas) y adjuntar los cubreobjetos de limpiar con una mezcla de 3:1 de parafina y vaselina. Derrita la parafina / mezcla de vaselina en un tubo cónico en un baño de agua hirviendo. Utilice un pincel pequeño y cubrir la parte inferior de la placa alrededor del agujero de 15 mm. Asegúrese de seguir revolviendo la parafina / mezcla de vaselina, ya que se separarán. Esto usualmente resulta en cámaras pegadas entre sí con una mayor concentración de la jalea de petróleo, que se convertirá en viscosa cuando los platos se colocan en la incubadora, lo que resulta en el desprendimiento de cubreobjetos. El resto de parafina / vaselina se puede almacenar a temperatura ambiente. Coloque el plato boca abajo sobre una bandeja plana y colocar el cubreobjetos sobre el agujero. Calor en el horno 80 ° C hasta que la mezcla de parafina se funde (~ 10 minutos). Quite los platos sobre una superficie plana y dejar que el conjunto de la mezcla de parafina. A su vez los platos una y esterilizar tanto el interior de las tapas y los fondos de las cámaras con luz UV. Cubreobjetos de abrigo o regiones de vidrio de las cámaras con 1.0mg/mL poli-D-lisina (30kDa) en tampón de borato (borato de sodio 0.1 M, pH 8,5) durante una hora. Enjuague 3-5 veces con abundante cantidad de agua de grado de cultivo de tejidos desionizada. Asegúrese de eliminar todos los rastros de tampón borato. Seco y utilizar inmediatamente o almacenar cámaras / cubreobjetos para su uso posterior. Por lo general, el uso cubreobjetos limpiar el plazo de un mes de preparación. 2. Preparación de la disección neuronal y medio de cultivo Preparar el medio de la disección (DM) mediante la adición de cantidades adecuadas de HBSS 10x y 100x HEPES al agua de grado de cultivo de tejidos. Almacenar a 4 ° C. Mantener en hielo durante la disección. El día antes de la disección de preparar el medio de chapado (PM) y el medio libre de suero (SFM). PM se compone de medio Neurobasal, suplemento de B27, 2 mM de glutamina, un 0,3% de glucosa, 37,5 mM de NaCl y 5% de suero fetal bovino (SFB). SFM se compone de medio Neurobasal, suplemento de B27, 2 mM de glutamina, un 0,3% de glucosa y 37,5 mM NaCl. Haz sólo lo suficiente para la disección y guardar en un cultivo de tejido durante la noche con la tapa de la incubadora entreabierta para que la temperatura y el contenido de CO 2 del medio se equilibra. Añadimos la glucosa extra y aumentar la osmolaridad de aproximadamente 310mOsm con NaCl. Nos encontramos con las culturas de hacerlo mejor en una osmolaridad más fisiológica (osmolalidad Neurobasal suele ser de 205 245mOsm). 3. Cortical alimentador gliales Preparación de capas de los cultivos a largo plazo Si a largo plazo, las culturas se han de preparar, realizar esta parte del protocolo de dos a tres semanas antes de continuar con las disecciones cortical o del hipocampo. Preparar el medio gliales (GM) con el MEM, el 0,3% de glucosa, penicilina / estreptomicina y 10% suero de caballo. Eutanasia P1-P3 crías de ratón de un enfriamiento en hielo durante 5 minutos. Eliminar a las crías en el hielo y gas con 70% de etanol. Rápidamente decapitar con unas tijeras. Quite todo el cerebro a un plato que contiene frío DM (paso 2.1). Retire los dos hemisferios cerebrales y las meninges. Impuestos Especiales de la corteza cerebral y trasladarlo a un nuevo plato que no contiene los medios de comunicación. Prepare las cortezas de cuatro cerebros total. Picar la corteza con un cuchillo limpio, maquinilla de afeitar estéril tan fina como sea posible y eliminar el tejido picado con una pipeta de plástico a un tubo cónico de 50 ml que contienen 12 ml de frío DM. Añadir la tripsina y DNasa a la concentración final de 0,25% (1,5 ml) y 0,1% (1,5 ml), respectivamente. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos con agitación intermitente. Retire el tubo que contiene el tejido cortical y limpiar a fondo con etanol al 70% antes de la puesta en el capó de cultivo de tejidos. Tejido cortical pipeta de arriba y abajo con una pipeta de 10 ml aproximadamente 10-15 horas, o hasta que la mayoría de los trozos de desaparecer. Devuelva el tubo a 37 ° C en un baño de agua durante 10 minutos con intermitentes remolino. Limpiar a fondo el tubo con etanol al 70% y traerlo de vuelta a la campana de cultivo de tejidos. Pipeta el tejido cortical de arriba a abajo con un 5 mL pipeta de aproximadamente 10-15 horas, o hasta que los trozos de desaparecer. Agregar 15 ml de agua tibia GM y centrifugar a 200xg (1000 rpm) durante 10 minutos. Desechar el sobrenadante, resuspender las células sedimentadas en 20 ml de agua dulce GM y contar con un hemocitómetro. Lámina 5-7.5×10 6 células en 15 ml de GM por 75 cm 2 matraz. Después de un día y cada 2-3 días posteriores en la cultura, separar las células sueltas, golpeando el frasco contra su mano. Eliminar el medio junto con las células desalojados y reemplazar con 15 ml de agua dulce GM. Glía se puede cosechar después de 1-2 semanas de crecimiento en los frascos, cuando están a punto 70-100% confluente. Para preparar cada cubreobjetos recubiertos con células gliales, lugar ácido nítrico 6 limpiar y esterilizar 25 mm cubreobjetos redondo en un plato de 10 cm, y el lugar 3 puntos de la mezcla de 3:1 de parafina / vaselina en cada portaobjetos en un patrón triangular con un pincel pequeño . El tratamiento de platos abiertos con luz UV durante 30 minutos. Cubra el cubreobjetos con 0,1 mg / ml de poli-D-lisina (30kDa) en tampón borato durante una hora, luego lave exhaustivamente (3 a 5 veces) con agua estéril de grado de cultivo de tejidos desionizada y dejar secar. Retirar el frasco que contiene la glía de la incubadora, se elimina el medio y enjuague con 5 ml de pre-calentado tripsina / EDTA. Retire la solución de tripsina / EDTA en el matraz y pipeta de 3 ml de agua dulce precalentado tripsina / EDTA en el matraz. Incubar el matraz durante 1 minuto a 37 ° C antes de añadir 5 ml de GM para detener la tripsina. Retire la glia del frasco por las reiteradas pipeteado 10-15 veces, y luego transferir los medios de comunicación a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 200xg (1000 rpm) durante 8 minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar 10 ml de GM, cuentan las células, y la placa de 5×10 células 5 en 12,5 ml de GM por plato de 10 cm que contiene el cubreobjetos. Intercambio con el medio fresco precalentado GM cada 2-3 días. El día antes de la disección de las neuronas, retire la GM y reemplazar con la ordenación forestal sostenible (sección 2.2). Utilice esta SFM gliales acondicionado en el paso 4.12, cuando las inundaciones cultivos corticales o del hipocampo. 4. Disección cortical y / o del hipocampo y la electroporación Eliminar la cantidad adecuada de soluciones nucleofection (Lonza), combinar, y la temperatura ambiente antes de comenzar la disección. Ya que la solución Nucleofection tiene una vida útil limitada cuando se combinan, sólo se combinan la cantidad necesaria para cada preparación (100 l por transfección). La eutanasia a un ratón embarazadas en E15.5 con CO 2 (día de enchufe E0.5) y extraer el útero de una placa de Petri de 10 cm. Eliminar los fetos y decapitar al frío DM (sección 2.1). Quite todo el cerebro en un plato aparte de frío DM y con una aguja de tungsteno dobladas, eliminar tanto neocortices. Quite la meninges con microforceps y cortezas lugar en nuevo plato frío de DM. Con una tijera pequeña iris o Wecker, quitar la corteza o el hipocampo y el lugar en un tubo Eppendorf de 1,5 ml lleno con 1,0 ml de frío DM. Mantenga este tubo en hielo. Después de la disección de todas las cortezas o hipocampos, añadir 110 l de 2,5% de tripsina al tubo Eppendorf que contiene el tubo de tejido y colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 20 minutos. Quitar la corteza sobrenadante y lavar o hipocampos con 1,0 mL PM (sección 2.2) suavemente invirtiendo el tubo Eppendorf. Repita el lavado dos veces, dejando 1 ml de la tarde en el tubo. Triturar los trozos de 15 veces con una pipeta P1000, y eliminar las células sobrenadante / a un nuevo tubo de 15 mL cónico que contiene 4 ml de la tarde, dejando a los trozos que quedan en el tubo Eppendorf. Girar el tubo de 15 ml en 20xg (350rpm) durante 7 minutos con el freno de apagado. Descartar el sobrenadante y añadir 100 ml de premezcla, la solución de sala de nucleofection temperatura (Lonza) para cada uno de transfección. Triturar 5 veces con un suave movimiento hacia arriba y abajo de la pipeta P1000. Eliminar 100 L de la solución nucleofection / célula mezcla a cada nuevo tubo Eppendorf y añadir la cantidad apropiada de ADN. A largo plazo las culturas que utilizan generalmente 1-2μg de ADN por la transfección. Sin embargo, esta etiqueta sólo una pequeña proporción <10% de las neuronas en la cultura. Por lo general, el uso de 5-10μg de DNA por transfección si desea una mayor eficiencia de transfección de la cultura a corto plazo. Hemos utilizado hasta un total de 40μg de ADN cuando la transfección con dos plásmidos diferentes. Los plásmidos son almacenados en buffer TE a 1 g / mL. Añadir la suspensión de células / ADN a la cubeta (Lonza) y electroporar las células en el Nucleofector (Lonza), mediante el programa S-005 (sistema nervioso central del ratón neuronas). Trabajando rápidamente, añadir 500 l de PM pre-calentado y equilibrada a la cubeta y remover la solución / células a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml. Añadir PM suficiente para reducir el volumen de cada transfección de 1,0 ml. Contar las células con un hemocitómetro y la placa en 3-5×10 3 células / cm 2 para los cultivos jóvenes, o 5-10×10 3 células / cm 2 para los cultivos a largo plazo. </ Li> A corto plazo las culturas, las inundaciones las placas de cultivo de 35 mm con 2,0 ml de calentado, CO 2-equilibrio SFM después de una hora de la siembra. Si se utiliza cubreobjetos, se elimina la mitad de la PM y reemplazarla con la ordenación forestal sostenible, y luego repetir dos veces más. Cualquiera de las inundaciones de las cámaras de imagen o el lavado de los resultados cubreobjetos en un contenido muy bajo en suero (<0,5%). A corto plazo las culturas no necesitan ser cultivadas con una capa de alimentación gliales y no necesitan volver a ser alimentado. De cultivos a largo plazo, eliminamos las células de un cubreobjetos cubiertos con tres puntos de parafina / vaselina e invertirlo en el agujero de 15 mm en la placa de 35 mm, una hora después de la siembra inicial. Dos mililitros de la ordenación forestal sostenible acondicionado en el plato gliales se añade a la cámara de imágenes. Para alimentar a los cultivos de largo plazo, se elimina un tercio de la ordenación forestal sostenible, cada 2-3 días y sustituirla por nueva, previamente calentada y CO 2-equilibrada ordenación forestal sostenible. 5. Los resultados representativos: Figura 1. Que viven las neuronas del hipocampo en las sucesivas etapas de desarrollo. Imágenes pareadas de representante vivo las neuronas del hipocampo se muestran tanto como una imagen de contraste de interferencia diferencial y una micrografía fluorescente correspondiente. Cada una de estas células ha sido transfectadas con EGFP-tubulina y DsRed2 en vectores pCAX. Las neuronas fueron estudiados en los próximos días in vitro (DIV): Etapa 1 (1DIV), nivel 2 (1DIV), Etapa 3 (2DIV), Etapa 4 (11DIV) y Etapa 5 (32DIV). Barra de escala es 20μm.