Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.
Abstract
נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד את מערכת העצבים המרכזית (CNS) קיטוב העצבית, האקסון / דנדריט תוצאה, היווצרות הסינפסה ותפקוד. היתרון של נוירונים אלה culturing היא שהם בקלות לקטב, להרכיב אקסונים הייחודי דנדריטים, על מצע דו מימדי בצפיפויות נמוכות מאוד. תכונה זו הפכה אותם מאוד שימושי לקביעת היבטים רבים של ההתפתחות העצבית. יתר על כן, על ידי מתן מיזוג גליה עבור הנוירונים האלה הם ימשיכו להתפתח, ויצרו קשרים סינפטיים פונקציונלי לשרוד במשך כמה חודשים בתרבות. בפרוטוקול זה אנו המתאר טכניקה לנתח, תרבות transfect נוירונים בהיפוקמפוס העכבר עובריים קליפת המוח. Transfection מושגת על ידי electroporating דנ"א לתוך הנוירונים לפני ציפוי באמצעות nucleofection. פרוטוקול זה יש את היתרון של להביע חלבונים היתוך fluorescently-tagged מוקדם בהתפתחות (~ 4-8hrs לאחר ציפוי) כדי ללמוד את הדינמיקה ואת התפקוד של החלבונים במהלך תוצאה, האקסון הקיטוב הסתעפות. גילינו גם כי זה transfection יחיד לפני ציפוי שומרת fluorescently-tagged חלבון ביטוי היתוך ברמות המתאימות הדמיה במהלך חייו של נוירון (> 2 חודשים בתרבות). לפיכך, מתודולוגיה זו שימושית ללימוד לוקליזציה חלבון ותפקוד בכל התפתחות מערכת העצבים המרכזית, עם הפרעה קטנה או לא של תפקוד עצבי.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה עבור עובריים culturing נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח עכבר פותחה כשינוי של פרוטוקול בנקאי, אשר משתמשת נוירונים 1,2 חולדה. השתמשנו בפרוטוקול זה על עכבר culturing ונוירונים אוגר גם 3,4,5,6,7. פרוטוקול זה פועל באותה מידה גם עבור שניהם נוירונים בהיפוקמפוס neocortical והוא דומה פרוטוקול שפורסם על ידי Meberg ומילר 8. באופן כללי, אנו משתמשים נוירונים בהיפוקמפוס לתרבות לטווח ארוך כי הם מאופיינים היטב מערכת מודל מבוססות יותר. יתר על כן, הם עשויים להכיל אוכלוסיה הומוגנית יותר של נוירונים מאשר הניאוקורטקס. עם זאת, נוירונים בתרבית neocortical בפרוטוקול זה גם לשרוד להבדיל דומה (נתונים שלא פורסמו). אנו משתמשים באופן שגרתי נוירונים בהיפוקמפוס neocortical לתרבות לטווח קצר. Dissection של הניאוקורטקס גם התוצאות נוירונים באופן משמעותי יותר (1.5×10 6 נוירונים בקליפת המוח לכל זוג) מאשר דיסקציה בהיפוקמפוס (2.5×10 5 נוירונים לכל זוג hippocampi), מה שהופך אותו בחירה טובה יותר של חומר סופג המערבי, למשל.
כמו כל תרבות ראשוני, חיוני כדי למזער את הזמן שזה לוקח ממותו של בעל החיים כדי ציפוי של התאים. זה יהיה בדרך כלל לוקח 10-20 והניתוחים להיות מהיר בעקביות לנתיחה ו ציפוי. כמו כן, כאשר עובדים עם Nucleofector Lonza, חשוב לעבוד במהירות במהלך ההליך electroporation, כמו את הכדאיות של נוירונים פוחתת במהירות אם הם נותרו למאגר nucleofection.
הרבה הדמיה שלנו מתנהל עם סך מיקרוסקופ פלואורסצנטי פנימי ההחזרה (TIRFM). סוג זה של מיקרוסקופיה הוא מסוגל רק הדמיה מאות ננומטרים אחדים מעבר coverslip. לכן, אזורים של נוירונים שאנו לעתים קרובות תמונה, חרוט צמיחה axonal ו הקוצים הדנדריטים, צריך להיות דבק ישירות coverslip. לפיכך, אנו משתמשים בתרבויות צפיפות נמוכה שדורשים האכלה גליה לתרבות לטווח ארוך. השתמשנו תרבויות צפיפות גבוהה (> 2×10 4 תאים / ס"מ 2), ללא שכבות מזין גליה, לטווח ארוך תרבויות גילו כי הם שורדים טוב מאוד עם מעט האכלה. עם זאת, הקוצים הדנדריטים של נוירונים אלה הם לעתים קרובות גם הרחק המצע על התמונה TIRFM, למרות שהם יכולים להתגלות בקלות עם מיקרוסקופ שדה רחב או מיקרוסקופיה confocal.
ברוב המחקרים שלנו אנו transfect נוירונים לפני ציפוי, ויש להם צילמו חלבונים fluorescently שכותרתו לתקופה של עד שלושה חודשים בתרבות. ביטוי זה לטווח ארוך של חלבונים fluorescently שכותרתו נותן לנו בטחון באמצעות ריכוזים נמוכים של דנ"א (1-2μg) אנחנו לא מייצרים חפצים overexpression בתוך הנוירונים. עם זאת, הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד overexpression של חלבונים אם כמויות גדולות של DNA משמשים (10-20μg). פלסמידים שבו אנו משתמשים כדי transfect נוירונים מכילים בדרך כלל EGFP או mCherry חלבונים היתוך, למרות שאנחנו גם התווית הציטופלסמה העצבית עם DsRed2 או EGFP לבד. טכניקה זו electroporation עובד היטב עם מספר וקטורים. אנחנו מעדיפים פלסמידים המכילים מקדם β-אקטין עם משפר CMV ו – β-גלובין מרובה זנב (pCAGGs או pCAX פלסמידים) 9, עקב רמות גבוהות יחסית של ביטוי, ואת העובדה כי הם נסבל היטב על ידי הנוירונים בתרבות הן בטווח הקצר והן לטווח הארוך. באופן כללי, חלבונים מתחילים להביע בתוך כ -4 שעות של ציפוי להגיע לרמות מספיקות הדמיה תוך 10-24hrs 10. השתמשנו בהצלחה CMV-האמרגן מונחה פלסמידים בתרבויות בטווח הקצר, אך גילו כי הם יכולים לגרום לרמות גבוהות של overexpression כי להרוג נוירונים בתרבית לטווח ארוך. עם זאת, מצאנו כי מיזוג של תרבויות גליה צפיפות נמוכה מסייעת להישרדות של נוירונים transfected עם CMV-האמרגן פלסמידים מונע, לעומת צפיפות (לא נמאס גליה) תרבויות גבוה יותר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת ויסקונסין ועדת טיפול בבעלי חיים היו בהתאם להנחיות NIH. אנו מודים לד"ר קתרין קליל לשימוש הנדיבה של המכשיר Nucleofector שלה. אנו מודים גם אנשי המעבדה דנט הערות על פרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R01-NS064014, דנה קרן וייטהול קרן אל EWD
כריסטופר Viesselmann, ג'ייסון Ballweg ודרק Lumbard תרמו באופן שווה על הנייר הזה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium Borate | Fisher | S93356 | Store borate buffer at room temperature (RT). | |
| Poly-d-Lysine | Sigma | P7886-100mg | Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C. | |
| Trypsin (10x) | Invitrogen | 15090-046 | Store aliquots at -80°C. | |
| DNase (10x) | Sigma | DN25-1G | Store aliquots at -80°C. | |
| MEM | Invitrogen | 11095-080 | Store at 4°C. | |
| HBSS (10x) | Invitrogen | 14185-052 | Store at RT. | |
| HEPES (100x) | Invitrogen | 15630-080 | Store at 4°C. | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Invitrogen | 15140-122 | Store aliquots at -80°C. | |
| Horse Serum | Hyclone | SH3007403 | Store aliquots at -80°C. | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25200-056 | Store at 4°C. | |
| Neurobasal E (NB) | Invitrogen | 21103-049 | Store at 4°C. | |
| B27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | Store aliquots at -80°C. | |
| Glutamine (100x) | Invitrogen | 25030-081 | Store aliquots at -80°C | |
| 30% Glucose in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP350-500 | Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
| 3.75M NaCl in NB (100X) | Fisher/Invitrogen | BP358-1 | Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH3007003 | Store aliquots at -80°C. | |
| Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w) | Fisher | Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1 | Combine in conical tube and melt in boiling water. | |
| Concentrated Nitric Acid (HNO3) | Fisher | A509-212 | Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows. | |
| 5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X) | Sigma | C6645 | Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C |
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.
References
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. Chapter 13. Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
- Dent, E. W., Kalil, K. Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton. Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).
- Dent, E. W. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).
- Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines. J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).
- Lebrand, C. Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1. Neuron. 42, 37-49 (2004).
- Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Chapter 7. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Zeitelhofer, M. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
