Summary

監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

Published: October 21, 2010
doi:

Summary

我々はの形成のための、シンプルで迅速かつ堅牢な方法を説明します<em>カンジダアルビカンス</emバイオフィルム内の細胞の抗真菌薬感受性試験では96ウェルマイクロタイタープレートと、そのユーティリティを使用して>バイオフィルム。

Abstract

カンジダアルビカンスは、標的患者とカンジダ症の拡大人口の真菌感染症の最も多い原因は、現在米国の病院で3番目に一般的な感染症である残ります。カンジダ症の異なる症状が両方のホストの組織および/または医療機器(すなわちカテーテル)で、バイオフィルム形成に関連付けられています。バイオフィルム内の細胞が宿主の免疫応答からと抗真菌薬の作用から保護されているバイオフィルム形成は、負の臨床的意義を運びます。我々は、Cの形成のための、シンプルで高速かつ堅牢なのin vitroモデルを開発したまた、バイオフィルム抗真菌薬感受性試験に使用できる96ウェルマイクロタイタープレートを、使用してカンジダバイオフィルム。このアッセイの読み出しは、代謝的に活性な菌のバイオフィルム細胞によるXTTの還元(テトラゾリウム塩)に基づいて、比色です。典型的な実験は、抗真菌薬感受性試験のための追加の24時間で、バイオフィルム形成のための約24時間かかります。そのシンプルさと一般に入手可能な実験材料および機器の使用から、この手法は、バイオフィルムの研究をdemocratizesと真菌バイオフィルムの抗真菌薬感受性試験の標準化に向けた重要な一歩を表しています。

Protocol

1。 C.の準備アルビカンス C. albicansはリスクグループ1/BSL1微生物である。常にこの微生物との仕事のために良好な無菌/滅菌技術を使用し、有害物質の適切な処分のための制度的な手順に従うことを覚えている。 C.の一晩培養を準備YPD(酵母ペプトンデキストロース)Cの単一コロニーを接種することにより液体培地でアルビカ?…

Discussion

ここでは、XTTを使ってバイオフィルム内の細胞の代謝活性を測定する比色法と相まって、カンジダバイオフィルムの形成のための、シンプル、迅速、経済的かつ再現性の高い96ウェルマイクロタイタープレートのモデルを説明します。バイオフィルム形成のためのこの96ウェルマイクロタイタープレートのモデルは、もともとC用に開発されたアルビカンスが、他のカン?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

実験室でのバイオフィルム関連の作業は、助成を受けた歯科&頭蓋顔面研究とアレルギー感染症(JLL – Rに。)国立研究所の国立研究所からR21DE017294とR21AI080930の番号が付けられています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIDCR、NIAIDまたはNIHの公式見解を表すものではありません。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sabouraud-dextrose agar   Becton Dickinson 211584 To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose   US Biological Y2076 Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine   Cellgro 50-020-PB Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)   Fisher BP308 To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS   Sigma P4417 Buffer for washes
XTT sodium salt   Sigma X4251 See above for preparation instructions
Ringer’s lactate   Hospira NDC0409-7953-09 For preparation of XTT solution
Menadione   Sigma M5625 Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes   Fisher 08-757-12  
15 ml conical centrifuge tubes   Corning 430790  
50 ml conical centrifuge tubes   Corning 430828  
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated   Corning 3595  
Multichannel pipette and tips   Eppendorf    
Incubator   Any    
Microtiter plate reader   Any    

References

  1. Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
  2. Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
  3. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
  4. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
  6. Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
  7. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  8. Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
  9. Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
  10. Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  11. Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
  12. Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).

Play Video

Cite This Article
Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms. J. Vis. Exp. (44), e2287, doi:10.3791/2287 (2010).

View Video