Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms
Summary
Beschrijven we een eenvoudige, snelle en robuuste methode voor de vorming van<em> Candida albicans</em> Biofilms met 96 well microtiterplaten en het nut van in antifungale testen van de gevoeligheid van de cellen in biofilms.
Abstract
Candida albicans blijft de meest voorkomende oorzaak van schimmelinfecties bij een groeiende populatie van gecompromitteerde patiënten en candidiasis is nu de derde meest voorkomende infectie bij Amerikaanse ziekenhuizen. Verschillende manifestaties van candidiasis worden geassocieerd met biofilm vorming, zowel op de host weefsels en / of medische hulpmiddelen (bijvoorbeeld katheters). Biofilmvorming draagt negatieve klinische implicaties, zoals cellen in de biofilms worden beschermd tegen gastheer immuunreacties en van de actie van de antischimmelmiddelen. We hebben een eenvoudige, snelle en robuuste in vitro model voor de vorming van C. albicans biofilms met 96 wells microtiterplaten-platen, die ook kan worden gebruikt voor de biofilm antischimmel gevoeligheid testen. Het uitlezen van deze test is colorimetrische, gebaseerd op de reductie van XTT (een tetrazolium zout) door de metabool actieve schimmel biofilm cellen. Een typisch experiment duurt ongeveer 24 uur voor de biofilmvorming, met een extra 24 uur voor antischimmel gevoeligheid testen. Door zijn eenvoud en het gebruik van algemeen beschikbare laboratorium-materiaal en apparatuur, deze techniek democratizes biofilm onderzoek en is een belangrijke stap op weg naar de standaardisatie van antifungale gevoeligheid testen van schimmel biofilms.
Protocol
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudige, snelle, zuinige en zeer reproduceerbaar 96 wells microtiterplaat model voor de vorming van Candida biofilms in combinatie met een colorimetrische methode die de metabole activiteit van cellen die maatregelen in de biofilm met behulp van XTT. Deze 96 wells microtiterplaat model voor de vorming van biofilm werd oorspronkelijk ontwikkeld voor C. albicans, maar kan gebruikt worden voor andere Candida spp. en eenvoudig worden aangepast voor andere schimmels organ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biofilm-gerelateerde werkzaamheden in het laboratorium wordt gefinancierd door subsidies genummerde R21DE017294 en R21AI080930 van het National Institute of Dental & Craniofaciale Onderzoek en het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (tot JLL-R.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIDCR, de NIAID of de NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sabouraud-dextrose agar | Becton Dickinson | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates | |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures | |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation | |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher | BP308 | To buffer RPMI 1640 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma | P4417 | Buffer for washes | |
| XTT sodium salt | Sigma | X4251 | See above for preparation instructions | |
| Ringer’s lactate | Hospira | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution | |
| Menadione | Sigma | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-12 | ||
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | ||
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | |||
| Incubator | Any | |||
| Microtiter plate reader | Any |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
