Summary

96 ألف لوحة حسنا Microtiter القائم على أسلوب تشكيل لمراقبة واختبار قابلية مضاد المبيضات البيض الأغشية الحيوية

Published: October 21, 2010
doi:

Summary

نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة وقوية لتشكيل<em> المبيضات البيض</em> الأغشية الحيوية باستخدام 96 لوحات microtiter جيدا وفائدتها في اختبار قابلية مضاد للخلايا داخل الأغشية الحيوية.

Abstract

المبيضات البيض يظل السبب الأكثر شيوعا للالتهابات فطرية في زيادة عدد السكان من المرضى للخطر والمبيضات الآن هو الثالث الأكثر شيوعا العدوى في المستشفيات في الولايات المتحدة. وترتبط مظاهر مختلفة من المبيضات مع تشكيل بيوفيلم ، سواء على أنسجة المضيف و / أو الأجهزة الطبية (القسطرة أي). تشكيل بيوفيلم دلالات سلبية السريرية ، ومحمية داخل خلايا الأغشية الحيوية من الاستجابات المناعية والمضيف من عمل مضادات الفطريات. وقد طورنا نموذجا بسيطا وسريعا وقويا في المختبر لتشكيل C. الأغشية الحيوية albicans به جيدا microtiter 96 لوحات ، والتي يمكن أن تستخدم أيضا لاختبار قابلية بيوفيلم مضاد. قراءات من هذا الاختبار هو اللونية ، على أساس الحد من XTT (أ tetrazolium الملح) بواسطة عملية الأيض نشطة بيوفيلم الخلايا الفطرية. تجربة نموذجية تأخذ ما يقرب من 24 ساعة لتشكيل بيوفيلم ، مع 24 ساعة إضافية لاختبار الحساسية المضادة للفطريات. بسبب بساطتها واستخدام المواد المتوفرة عادة المختبرات والمعدات ، وهذه التقنية نظاما ديمقراطيا البحوث بيوفيلم ويمثل خطوة مهمة نحو توحيد اختبار الحساسية من الفطريات الأغشية الفطرية.

Protocol

1. إعداد C. albicans C. albicans هو مجموعة الكائنات الحية الدقيقة 1/BSL1 المخاطر. تذكر دائما أن حسن استخدام تقنيات العقيم / معقمة للعمل مع هذه الكائنات الدقيقة ومتابعة الإجراءات المؤسسية في مجال التخلص السليم من المواد بيولوجية. <ol st…

Discussion

نحن هنا وصف بسيط وسريع والاقتصادية واستنساخه غاية 96 لوحة microtiter نموذج جيد لتشكيل الأغشية الحيوية المبيضات مقرونا اللونية الأسلوب الذي يقيس النشاطات الأيضية من الخلايا داخل بيوفيلم XTT به. وقد تم تطوير هذا الأصل 96 لوحة microtiter كذلك نموذجا لتشكيل بيوفيلم لجيم وي…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويتم تمويل بيوفيلم ذات الصلة العمل في المختبر من المنح ومرقمة R21DE017294 R21AI080930 من المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والجمجمة ، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (لJLL – R). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للNIDCR ، NIAID أو في المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sabouraud-dextrose agar   Becton Dickinson 211584 To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose   US Biological Y2076 Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine   Cellgro 50-020-PB Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)   Fisher BP308 To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS   Sigma P4417 Buffer for washes
XTT sodium salt   Sigma X4251 See above for preparation instructions
Ringer’s lactate   Hospira NDC0409-7953-09 For preparation of XTT solution
Menadione   Sigma M5625 Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes   Fisher 08-757-12  
15 ml conical centrifuge tubes   Corning 430790  
50 ml conical centrifuge tubes   Corning 430828  
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated   Corning 3595  
Multichannel pipette and tips   Eppendorf    
Incubator   Any    
Microtiter plate reader   Any    

References

  1. Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
  2. Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
  3. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
  4. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
  6. Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
  7. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  8. Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
  9. Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
  10. Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  11. Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
  12. Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).

Play Video

Cite This Article
Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms. J. Vis. Exp. (44), e2287, doi:10.3791/2287 (2010).

View Video