全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

1。成長する植物と準備細菌 V：：Vの生育培地の混合物（熱地-地球のプラグと苗ミックス、サングロ）、細かいバーミキュライト、パーライトおよびこの手順を開始するには、午前1時01分01秒Vのシロイヌナズナの種子をまく。 成長チャンバー（22℃、100μモル/ mm 2の /秒毎日の光と65の12時間± 5％湿度）及び必要に応じて水で植物を育てる。植物は、彼らが前にボルトに若い完全に展開された葉を持っている場合4-6週間で使用する準備が整いました。 実験を始める前に二日は、細菌の培養を準備。修正されたLB培地（10g / Lのトリプトン、5g / Lの酵母エキス、5g / lの塩化ナトリウム液（pH7.0）、および1.5％寒天）と28で24時間インキュベート℃の上にグ ​​リセロールストックからストリークシュードモナスシリン接種を準備し、常に細菌が継代培養後の弱毒になるとグリセロールストックから培養プレートを開始するために新鮮な培養を使用してください。 P. 10 mLの液体培養を開始するためにプレート上に成長した細菌を使用してください50 mLの三角フラスコにシリン 。 28で一晩培養液を振とうしながら精力的で、Cをそれが0.8と1の間の600 nmにおける光学密度またはODに達するまで。 600 ODを測定し、10分間1360 × gで遠心分離により細胞を収穫。最後のODが0.2になるように蒸留水で細胞を再懸濁します。このODは10 8コロニー形成単位（CFU）/ mLに相当する。準備が細菌で、葉を準備し、アッセイを行うために進んでください。 2。バクテリアと葉の染色とインキュベーション染色するために、葉はまず水に20μMのヨウ化プロピジウムまたはPI溶液を調製。溶液10 mL、一度に3つの小さな葉を染色するのに十分です。 成長チャンバーから植物を取得し、鉗子で3若い、完全に展開した葉を切り離します。 5分間のPI溶液中で全体の葉を浸し。その後、葉を取り除き、蒸留水で簡単にそれらを洗い流してください。 次の場所下面は、顕微鏡スライド上に下向きに持つ葉。葉がスライド上に平らになるようにミッド静脈を除く4つの部分に鋭いカミソリの刃を持つ葉を切り取ります。 葉で細菌を培養するために、スライド上の葉の部分の下に細菌懸濁液300μLを加える。葉の下面は、接種に接触していることを確認してください。 植物を育てるために使用されたのと同じ環境条件でサンプルをインキュベートする。顕微鏡下で葉を観察する時に、上を向く下面との新しいスライドに葉の部分を転送する。スライドをマウントするときに、カバースリップが使用されていないことに注意してください。同じ葉の試料はインキュベーションの間に複数回撮像することができ、時間の経過は、研究目的に応じて設定することができる。 3。顕微鏡、測定とデータ解析ここでは共焦点顕微鏡（LSM 510メタ、カールツァイス社）をスキャンするレーザーは、葉を調べるために使用されます。 PI（励起453 nmの発光543および620nm）の蛍光を検出するために、葉の下面を観察。 同じ葉のサンプルを使用すると、時間の経過とともに気孔の画像をキャプチャ。気孔開口部の幅を測定するために画像を保存します。 LSMの画像のブラウザを使用して、各時点における各治療のために少なくとも60気孔の気孔開口部の幅を測定します。 気孔開口部の幅の平均と標準誤差を計算する。結果の統計的有意性は、2尾、ペアワイズスチューデントのt検定を用いて計算することができます。 4。細菌とのインキュベーションに気孔応答の代表的な画像ここで明視野のビュー（図1）におけるレーザー走査型共焦点顕微鏡下でシロイヌナズナの葉の表面の典型的な顕微鏡画像は、（20倍対物レンズを用いて）です。 ヨウ化プロピジウム染色生細胞の細胞壁は、データの収集（図2）のための無傷の細胞の同定を可能に加えて、孔辺細胞の可視性を高める。気孔孔開口部の範囲が広く開いている気孔に完全に閉じた気孔から、これらの顕微鏡写真で見ることができます。 完全に閉じた気孔は孔辺細胞の形状（図3）によって識別されます。開口幅は、0μmと考えられている。 オープン気孔（図4）で示した開口幅は、気孔孔の広い領域にわたって描かれた直線を用いて測定されます。 これらは、この気孔アッセイの代表的な実験結果です。Arabidopisの葉は、 シュードモナスシリンの3つの異なる株で、暗所でインキュベートした。唯一の細菌は、PST DC3000は、菌株ごとにランダムに選ばれた60気孔（図5）の開口幅で測定された暗閉じた気孔を、開くことができました。 </oL> 図1。 シロイヌナズナの葉の表面の顕微鏡写真。20倍の対物レンズを用いてレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）下葉の表面のビューの1つのフィールドを変更します。気孔の開口は、ヨウ化プロピジウム染色（図2）によって支援蛍光ビューと比較して明らかなようにではないことに注意してください。 図2。ヨウ化プロピジウム染色シロイヌナズナの葉の表面の顕微鏡写真。20倍の対物レンズを用いてレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）下葉の表面のビューの1つのフィールド。気孔の孔の開口部の範囲に注意してください。黄色の矢印は、完全に気孔を閉じるために指摘されていると緑色の矢印が広く開いた気孔を指摘されています。 図3。の形状と孔辺細胞の間の開口部で識別される、完全に近い気孔。開口幅は、0μmと考えられている。 図4。ミクロンの開口幅を示す開いた気孔測定は、気孔の孔の広い領域にわたって引かれた直線に基づいてLSCMブラウザを使用して撮影した。 図5。 シュードモナスシリン PVの3株とインキュベートしたシロイヌナズナの葉の気孔開口トマト ：。。DC3118、DB29、およびDC3000植物は、実験時に暗闇に格納されていました。結果は平均値（N = 50から70まで）±標準誤差として示されています。統計学的有意性は、両側スチューデントt -テストで検出した。実験は、同様の結果を3回繰り返した。