Die Beurteilung stomatäre Response to Bakterienzellen Live mit Whole Leaf Imaging
Summary
Wir haben eine einfache und reproduzierbare Protokoll Stomata Reaktion auf lebende Bakterien Zugang entwickelt. Diese Methode minimiert Verwundung und Manipulation des Blattes über die Nutzung von epidermalen schält Vergleich bereits berichtet.
Abstract
Stomata sind natürliche Öffnungen in der Anlage Epidermis verantwortlich für den Gasaustausch zwischen Pflanze Innen-und Umwelt. Sie sind durch ein Paar von Schließzellen, die in der Lage, die Stomata Pore in Reaktion auf eine Reihe von externen Faktoren wie Lichtintensität, Kohlendioxid-Konzentration, und die relative Luftfeuchtigkeit (RH) in der Nähe entstehen. Die Stomata Pore ist auch die Hauptroute für den Erregernachweis Eintrag in die Blätter, ein entscheidender Schritt für die Entwicklung der Krankheit. Jüngste Studien haben enthüllt, dass die Schließung der Poren wirksam minimiert bakterielle Erkrankung Entwicklung in Arabidopsis-Pflanzen ist, ein integraler Bestandteil der Anlage angeborenen Immunität. Bisher haben wir epidermalen Schalen verwendet, um Stomata Antwort zu bewerten, um Bakterien (Melotto et al 2006.) Leben, aber die Aufrechterhaltung günstiger Umweltbedingungen für beide Anlagen epidermalen Peelings und bakteriellen Zellen war eine echte Herausforderung. Blattepidermis gehalten lebendig und gesund mit MES-Puffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6,15) für elektrophysiologische Experimente von Schließzellen werden. Allerdings ist dieser Puffer nicht geeignet für den Erhalt Bakteriensuspension. Auf der anderen Seite, können bakterielle Zellen am Leben erhalten in Wasser, das ist nicht richtig, epidermal Peelings für längere Zeit aufrecht zu erhalten. Wenn eine epidermale peel schwimmt auf dem Wasser, wodurch die Zellen in der Schale, die an der Luft trocknen innerhalb von 4 Stunden ausgesetzt sind, das Timing, das Experiment durchzuführen. Eine ideale Methode zur Beurteilung der Wirkung eines bestimmten Reizes auf der Hut Zellen sollten minimal Störungen Stomata Physiologie und der natürlichen Umgebung der Pflanze so viel wie möglich zu präsentieren. Wir haben deshalb eine neue Methode entwickelt, um Stomata Antwort zu bewerten, um Bakterien, in denen Blatt Verwundung und Manipulation stark minimiert zielt darauf ab, eine leicht reproduzierbare und zuverlässige Stomata Assay bieten zu leben. Das Protokoll basiert auf Färbung der intakten Blattes mit Propidiumiodid (PI), die Inkubation Färbung Blatt mit Bakteriensuspension und Beobachtung der Blätter unter Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop. Schließlich ermöglicht dieses Verfahren für die Beobachtung der gleichen Live-Blatt Probe über längere Zeit mit Bedingungen, die genau imitieren die natürlichen Bedingungen, unter denen Pflanzen mit Krankheitserregern angegriffen werden.
Protocol
Discussion
Wir haben ein straight forward Verfahren Stomata Öffnung in intakten Blattgewebe ermöglicht eine einfache Beurteilung der Stomata Reaktion auf unterschiedliche Behandlungen Maßnahme.
Obwohl wir die Ergebnisse mit dem Modellsystem Arabidopsis / Pseudomonas syringae vorgestellt haben, kann der intakten Blattes Stomata Assay potenziell mit jedem Werk-Bakterium Kombination durchgeführt werden. Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um notwendige Wachstum von anderen Pflanzen und bakterielle Erreger angepasst werden. Das übergeordnete Prinzip und Verfahren bleiben gleich. Darüber hinaus kann diese Methode nützlich sein, um Forscher, die funktionale Leistung von Schließzellen nicht nur Mikroben leben studieren wollen, sondern auch auf andere Reize und chemische Kampfstoffe unter Bedingungen, die das Blatt die natürliche Umwelt zu erhalten.
Whole Blatt kann schwierig sein Bild aufgrund seiner Dicke und unebenen Topographie. Dieses Problem kann durch das Entfernen der Vene Mitte des Blattes so dass es flach auf den Schlitten und mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie gelindert werden. Jedoch können auch andere Arten von Fluoreszenz-Mikroskop verwendet, um Bilder mit hoher Auflösung von der Blattoberfläche zu erhalten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health und der University of Texas at Arlington einrichten Mittel MM unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | ||
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | ||
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | ||
| Sodium Chloride | VWR | 7647-14-5 | ||
| Agar | Bio Express | J637-2500G | ||
| Plant growth chamber | ||||
| Shaker incubator | ||||
| Laser scanning confocal microscope |
References
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