تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف
Summary
قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وقابلة للتكرار للوصول إلى استجابة فوهي للبكتيريا حية. هذا الأسلوب يقلل من اصابة والتلاعب في أوراق بالمقارنة مع استخدام قشور البشرة ذكرت سابقا.
Abstract
الثغور هي الفتحات الطبيعية في البشرة النباتية المسؤولة عن تبادل الغازات بين النبات والبيئة الداخلية. تتشكل من قبل زوج من خلايا الحرس ، والتي هي قادرة على إغلاق المسام فوهي ردا على عدد من العوامل الخارجية بما في ذلك شدة الضوء ، تركيز ثاني أكسيد الكربون ، والرطوبة النسبية (RH). المسام فوهي هو أيضا الطريق الرئيسي لدخول العامل الممرض في الأوراق ، وخطوة حاسمة بالنسبة لتطور المرض. وقد كشفت الدراسات الحديثة أن إغلاق المسام فعال في الحد من تطور المرض الجرثومي في النباتات Arabidopsis ، جزءا لا يتجزأ من مناعة النبات الفطرية. سابقا ، وقد استخدمنا قشور البشرة لتقييم الاستجابة للعيش فوهي البكتيريا (Melotto وآخرون 2006) ؛ الحفاظ على الظروف البيئية غير المواتية لقشور النبات على حد سواء البشرة والخلايا البكتيرية قد التحدي. يمكن أن تبقى على قيد الحياة ورقة البشرة وصحية مع العازلة زارة التربية والعلم (10 ملي بوكل ، 25 مم ، MES كوه ، ودرجة الحموضة 6.15) للتجارب الكهربية للخلايا الحراسة. ومع ذلك ، هذا المخزن ليس من المناسب للحصول على تعليق البكتيرية. من ناحية أخرى ، يمكن أن تبقى على قيد الحياة في الخلايا البكتيرية الماء الذي ليس من المناسب للحفاظ على القشور البشرة لفترة طويلة من الوقت. عندما يطفو على الماء قشر البشرة ، والخلايا في القشرة التي تتعرض لجفاف الهواء في غضون 4 ساعات الحد من توقيت لإجراء التجربة. يجب على الأسلوب الأمثل لتقييم تأثير حافز خاص على خلايا الحرس الحاضر إلى الحد الأدنى من التدخل الفيزيولوجيا فوهي وعلى البيئة الطبيعية من النبات قدر الإمكان. نحن ، بالتالي ، وضعت طريقة جديدة لتقييم الاستجابة للعيش فوهي البكتيريا التي يتم تصغير كثيرا اصابة الأوراق والتلاعب التي تهدف إلى توفير مقايسة استنساخه بسهولة وموثوق بها فوهي. يستند هذا البروتوكول على تلوين أوراق سليمة مع يوديد propidium (PI) ، حضانة تلوين نبات مع تعليق البكتيرية ، والمراقبة من أوراق تحت مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. أخيرا ، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة من العينة نبات يعيش نفسه على مدى فترات طويلة من الوقت باستخدام الظروف التي تحاكي بشكل وثيق في ظل الظروف الطبيعية التي تتعرض للهجوم من قبل النباتات مسببات الأمراض.
Protocol
Discussion
قدمنا إجراء مستقيم إلى الأمام لقياس الفتحة فوهي في أنسجة نبات سليمة تسمح بتقييم سهولة استجابة فوهي للعلاجات المختلفة.
على الرغم من أننا قد قدمت النتائج باستخدام نظام نموذجي Arabidopsis / syringae الزائفة ، يمكن فحص أوراق سليمة فوهي تنفيذ محتملة مع أي مزيج من النباتات بكتيريا. ويمكن بسهولة البروتوكول يمكن تعديلها لتناسب متطلبات نمو النباتات الأخرى ، ومسببات الأمراض البكتيرية. والمبدأ العام والإجراءات لا تزال هي نفسها. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الأسلوب قد تكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في الدراسة الفنية للانتاج خلايا الحرس ليس فقط للعيش الميكروبات ، ولكن أيضا لمنبهات أخرى ، والعوامل الكيميائية في ظل الظروف التي تحافظ على البيئة الطبيعية لنبات.
يمكن نبات كله يكون من الصعب الصورة بسبب سماكة والتضاريس متفاوتة. ويمكن التخفيف من حدة هذه المشكلة عن طريق إزالة الوريد منتصف الورقة بحيث يضع مسطح على الشريحة وباستخدام المجهر مبائر. ومع ذلك ، يمكن استخدام أنواع أخرى من مضان المجهر للحصول على صور عالية الدقة لسطح الورقة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من خلال منحة من المعهد الوطني للصحة وجامعة تكساس في أرلينغتون إنشاء صناديق لMM.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | ||
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | ||
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | ||
| Sodium Chloride | VWR | 7647-14-5 | ||
| Agar | Bio Express | J637-2500G | ||
| Plant growth chamber | ||||
| Shaker incubator | ||||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y., Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. , (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
