Het beoordelen van stomatale Reactie op bacteriële cellen Live met behulp van Whole Leaf Imaging
Summary
We hebben een eenvoudige en reproduceerbare protocol om stomatale reactie op de levende bacteriën te openen. Deze methode minimaliseert verwonden en manipulatie van het blad ten opzichte van het gebruik van de epidermale schillen eerder gerapporteerd.
Abstract
Huidmondjes zijn natuurlijke openingen in de installatie epidermis die verantwoordelijk is voor de uitwisseling van gassen tussen plant interieur en omgeving. Ze worden gevormd door een paar van de wacht cellen, die in staat zijn om de stomatale porie dicht in reactie op een aantal externe factoren, zoals lichtintensiteit, koolstofdioxide concentratie, en de relatieve vochtigheid (RH). De stomatale porie is ook de belangrijkste route voor pathogeen toegang tot bladeren, een cruciale stap voor de ziekte van ontwikkeling. Recente studies hebben onthuld dat de sluiting van de porie is effectief in het minimaliseren van bacteriële ziekte in Arabidopsis planten, een integraal onderdeel van plant aangeboren immuniteit. Eerder hebben we gebruikt epidermale peelings om stomatale respons te beoordelen op bacteriën (Melotto et al., 2006.) Leven; ook om de gunstige milieu-omstandigheden voor zowel planten epidermale peelings en bacteriële cellen is uitdagend. Bladepidermis levend gehouden kan worden en gezond met MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6,15) voor de elektrofysiologische experimenten sluitcellen. Echter, deze buffer is niet geschikt voor het verkrijgen van bacteriële suspensie. Aan de andere kant kan bacteriële cellen worden in leven gehouden in water dat niet eigen is aan epidermale schillen te behouden voor een lange periode van tijd. Wanneer een epidermale schil drijft op het water, de cellen in de schil, die aan de lucht drogen blootgesteld binnen 4 uur het beperken van de timing om het experiment uit te voeren. Een ideale methode voor het beoordelen van het effect van een bepaalde stimulus op sluitcellen moet indienen minimale interferentie stomatale fysiologie en om de natuurlijke omgeving van de plant zoveel mogelijk. We daarom een nieuwe methode ontwikkeld om stomatale respons te beoordelen aan bacteriën in die bladeren verwonden en manipulatie sterk wordt geminimaliseerd gericht op een gemakkelijk reproduceerbaar en betrouwbaar stomatale assay te bieden wonen. Het protocol is gebaseerd op de kleuren van intacte blad met propidiumjodide (PI), incubatie van kleuren blad met bacteriële suspensie, en observatie van de bladeren onder laser scanning confocale microscoop. Tot slot is deze methode laat voor de observatie van dezelfde live-blad steekproef over langere tijd met behulp van omstandigheden die nauw nabootsen van de natuurlijke omstandigheden waaronder planten worden aangevallen door ziekteverwekkers.
Protocol
Discussion
We hebben presenteerde een rechttoe rechtaan procedure om stomatale diafragma te meten in intacte bladweefsel waardoor een eenvoudige beoordeling van stomatale reactie op de verschillende behandelingen.
Hoewel we hebben gepresenteerde resultaten met behulp van het modelsysteem Arabidopsis / Pseudomonas syringae, kan de intacte blad stomatale test mogelijk worden uitgevoerd met een plant-bacterie combinatie. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om de gewenste groei van andere planten en bacteriële pathogenen te passen. Het algemene principe en de procedure blijven hetzelfde. Daarnaast kan deze methode nuttig voor onderzoekers die willen functionele output van sluitcellen niet alleen tegen microben leven studeren, maar ook voor andere stimuli en chemische stoffen onder omstandigheden die het blad de natuurlijke omgeving te behouden.
Hele blad kan moeilijk zijn om de afbeelding door zijn dikte en ongelijke topografie. Dit probleem kan worden verholpen door het verwijderen van het midden van de ader van het blad, zodat het ligt plat op de glijbaan en het gebruik van confocale microscopie. Maar ook andere vormen van fluorescentie microscoop gebruikt worden om hoge resolutie afbeeldingen van het bladoppervlak te verkrijgen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het National Institute of Health en de Universiteit van Texas in Arlington fondsen opgericht op MM.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | ||
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-1 | ||
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | ||
| Sodium Chloride | VWR | 7647-14-5 | ||
| Agar | Bio Express | J637-2500G | ||
| Plant growth chamber | ||||
| Shaker incubator | ||||
| Laser scanning confocal microscope |
References
- Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y., Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis Book. , (2002).
- Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato. Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126, 969-980 (2006).
