Summary

Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro</em

Published: June 01, 2010
doi:

Summary

Т-лимфоцитов происходит во время миграции самонаведения для лимфоидных органов, выход из сосудистой сети, и вступление в периферических тканях. Здесь мы опишем протокол, который может быть использован для анализа миграции Т-лимфоцитов<em> В пробирке</em>.

Abstract

Миграции Т-лимфоцитов включает в себя клей взаимодействия интегрины клеточной поверхности с лигандами, выраженные на другие клетки или с белками внеклеточного матрикса. Точное пространственно-временной активации интегринов из низком состоянии сродство к высоким сродством состояние на клеточном передний край имеет важное значение для Т-лимфоцитов миграции<sup> 1</sup>. Кроме того, втягивание ячейки задней кромке, или уропод, является необходимым шагом в сохранении стойкие интегрин-зависимые Т-лимфоцитов моторики<sup> 2</sup>. Многие терапевтические подходы к аутоиммунных или воспалительных заболеваний целевой интегринов как средство для подавления чрезмерного найму и миграции лейкоцитов<sup> 3</sup>. Для изучения молекулярных событий, которые регулируют человеческие Т-лимфоцит миграции, мы использовали<em> В пробирке</em> Системы для анализа миграции клеток на двумерной подложке, которая имитирует среду, что Т-лимфоцитов встреч во время набора из сосудов. Т-лимфоциты являются впервые выделен от человека доноров и затем стимулировали и культивировали в течение семи-десяти дней. Во время теста, Т-лимфоциты могут придерживаться и мигрируют на подложке покрытой межклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1), лиганд для интегрин LFA-1 и стромальных клеток-производных фактора-1 (SDF-1). Наши данные показывают, что Т-лимфоциты обладают миграционных скоростью ~ 15 мкм / мин. Т-лимфоцитов миграция может быть затруднена блокады интегрина<sup> 1</sup> Или ингибиторами клеточный механизм, регулирующий актомиозина миграции клеток<sup> 2</sup>.

Protocol

1. Выделение лимфоцитов человека Т Получить крови человека от здорового донора. Дайте крови остыть до комнатной температуры (~ 30 мин), прежде чем перейти к следующему шагу. Аккуратно пипетки 3 мл комнатной температуре СМИ Polymorph градиента плотности в 8 мл с круглым дном полистир?…

Discussion

В этом эксперименте мы предоставляем подробную информацию о простой системы для анализа подвижности первичных человеческих Т-лимфоцитов. В анализах пробирке миграции были использованы для рассекать ролей многих молекул и сигнальных путей, участвующих в локомоции различны?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект был поддержан Национальным институтом здоровья Гранты HL087088 (МК) и HL18208 (МК).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
RPMI 1640   Gibco 11875  
FBS   Thermo Scientific SH300070.03  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
1-Step Polymorphs   Accurate Chemical AN221725  
PHA   Remel/Fisher Scientific R30852801  
Rec. human IL-2   R&D Systems 202-IL  
Rec. human IL-15   R&D Systems 247-IL  
Protein G   Sigma Aldrich 19459  
Rec. human ICAM-1/Fc   R&D Systems 720-IC  
Rec. human SDF-1   R&D Systems 350-NS  

References

  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
  3. Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).

Play Video

Cite This Article
Lefort, C. T., Kim, M. Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro. J. Vis. Exp. (40), e2017, doi:10.3791/2017 (2010).

View Video