Isolamento linfociti T umani, la cultura e l'analisi delle migrazioni In Vitro</em
Summary
La migrazione dei linfociti T si verifica durante homing verso gli organi linfoidi, uscire dal sistema vascolare, e di entrare in tessuti periferici. Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per analizzare la migrazione dei linfociti T<em> In vitro</em>.
Abstract
La migrazione dei linfociti T richiede l'interazione adesiva delle integrine superficie cellulare con ligandi espressi su altre cellule o con proteine della matrice extracellulare. L'attivazione delle integrine preciso spazio-temporale da uno stato a bassa affinità ad uno stato ad alta affinità al bordo cellula principale è importante per la migrazione dei linfociti T<sup> 1</sup>. Allo stesso modo, retrazione del bordo d'uscita delle cellule, o uropod, è un passo necessario a mantenere persistente integrina-dipendente motilità dei linfociti T<sup> 2</sup>. Molti approcci terapeutici per autoimmuni o infiammatorie integrine obiettivo malattie come mezzo per inibire l'eccessiva reclutamento e la migrazione dei leucociti<sup> 3</sup>. Per studiare gli eventi molecolari che regolano la migrazione dei linfociti T umani, abbiamo utilizzato un<em> In vitro</emSistema> per analizzare la migrazione delle cellule su un substrato bidimensionale che simula l'ambiente che un linfocita T incontra durante il reclutamento dal sistema vascolare. Linfociti T vengono prima isolati da donatori umani e vengono poi stimolati e in coltura per 7-10 giorni. Durante il test, i linfociti T possono aderire e migrare su un substrato rivestito con molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), un ligando per integrina LFA-1 e cellule stromali derivate fattore-1 (SDF-1). I nostri dati mostrano che i linfociti T presentano una velocità migratorio di ~ 15 micron / min. La migrazione dei linfociti T può essere inibita dal blocco delle integrine<sup> 1</sup> O con inibitori della macchina actomiosina cellulare che regola la migrazione delle cellule<sup> 2</sup>.
Protocol
Discussion
In questo esperimento, forniamo i dettagli su un sistema semplice per analizzare la motilità del primario linfociti T umani. Saggi di migrazione in vitro sono stati utilizzati per sezionare i ruoli di molte molecole e le vie di segnalazione coinvolte nella locomozione dei vari tipi di cellule. Alcuni controlli critici da tenere a mente quando si progetta l'esperimento proprio dal nostro protocollo sono: 1) non-adesivo o non-integrina rivestimenti substrato adesivo, come sieroalbumina bovina (BSA) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto dal National Institutes of Health Borse HL087088 (MK) e HL18208 (MK).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Gibco | 11875 | ||
| FBS | Thermo Scientific | SH300070.03 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical | AN221725 | ||
| PHA | Remel/Fisher Scientific | R30852801 | ||
| Rec. human IL-2 | R&D Systems | 202-IL | ||
| Rec. human IL-15 | R&D Systems | 247-IL | ||
| Protein G | Sigma Aldrich | 19459 | ||
| Rec. human ICAM-1/Fc | R&D Systems | 720-IC | ||
| Rec. human SDF-1 | R&D Systems | 350-NS |
References
- Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
- Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
- Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).
