T-lymfocyt migratie vindt plaats tijdens homing aan lymfoïde organen, het verlaten van het vaatstelsel en het aangaan van perifere weefsels. We beschrijven hier een protocol dat gebruikt kan worden om T-lymfocyten migratie te analyseren<em> In vitro</em>.
Abstract
De migratie van T-lymfocyten houdt de lijm interactie van het celoppervlak integrines met liganden uitgedrukt op andere cellen of met extracellulaire matrix eiwitten. De precieze spatiotemporele activering van integrines van een lage affiniteit staat om een hoge affiniteit toestand bij de cel leading edge is belangrijk voor de T-lymfocyt migratie<sup> 1</sup>. Ook terugtrekken van de cel achterrand of uropod, is een noodzakelijke stap in het onderhouden van aanhoudende integrine-afhankelijke T-lymfocyt motiliteit<sup> 2</sup>. Vele therapeutische benaderingen van auto-immuunziekten of ontstekingsziekten doel integrines als een middel om het buitensporige werving en migratie van leukocyten remmen<sup> 3</sup>. De studie van de moleculaire gebeurtenissen die de menselijke T-lymfocyten migratie te reguleren, hebben we gebruik gemaakt een<em> In vitro</em> Systeem naar cel migratie te analyseren op een twee-dimensionale substraat dat de omgeving die een T-lymfocyt tegenkomt bij de werving van het vaatstelsel nabootst. T-lymfocyten worden eerst geïsoleerd uit menselijke donoren en worden vervolgens gestimuleerd en gekweekt voor zeven tot tien dagen. Tijdens de test, zijn T-lymfocyten mogen hechten en migreren op een substraat bekleed met intercellulaire adhesie molecule-1 (ICAM-1), een ligand voor integrine LFA-1, en stromale cel-afgeleide factor-1 (SDF-1). Onze gegevens tonen aan dat T-lymfocyten een trekkende snelheid van ~ 15 micrometer / min vertonen. T-lymfocyt migratie kan worden geremd door integrine blokkade<sup> 1</sup> Of door remmers van de cellulaire actomyosin machines die regelt celmigratie<sup> 2</sup>.
Protocol
1. Isolatie van menselijke T-lymfocyten Verkrijgen menselijk bloed van een gezonde donor. Laat het bloed op kamertemperatuur (~ 30 min) afkoelen voordat u verder gaat met de volgende stap. Voorzichtig Pipetteer 3 ml kamertemperatuur Polymorph dichtheidsgradiënt media in een 8 ml ronde bodem polystyreen buis. Voorzichtig Voeg 3 ml bloed op de top van de Polymorph media. Het is belangrijk om te voorkomen dat het mengen van de twee reagentia. Centrifugeer de buizen op 500 xg gedurende 45 min…
Discussion
In dit experiment geven we details over een eenvoudig systeem om de beweeglijkheid van de primaire menselijke T-lymfocyten te analyseren. In vitro migratie testen zijn gebruikt om de rol van de vele moleculen en signaalwegen die betrokken zijn bij de motoriek van de verschillende celtypes ontleden. Een aantal kritische controles in gedachten te houden bij het ontwerpen van je eigen experiment uit ons protocol zijn: 1) Niet-klevende en niet-klevende integrine substraat coatings, zoals bovine serum albumine (BSA)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd ondersteund door National Institutes of Health subsidies HL087088 (MK) en HL18208 (MK).