Summary

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Published: March 05, 2010
doi:

Summary

이 비디오에서는, 우리는 CD40 – 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마​​우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.

Abstract

B 세포에 관한 연구는 CD40 활성화들은 항원 프레 젠 테이션 능력을 향상하는 것으로 나타났습니다. 인터루킨 – 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극을 때, 인간의 B 세포는 고도로 순수 CD40 – B 세포 (매우 큰 금액을 14 일 이내에 말초혈 소량의 어려움없이 확장 가능> 10<sup> 9</sup건강한 기증자뿐만 아니라 암 환자에서 환자마다> 전지)<sup> 1-4</sup>. CD40 – B 세포 중요한 림프절 유도 분자를 표현하고 T 세포를 유도할 수<em> 체외에서</em<sup> 5</sup>. 또한 그들은 효율적으로 T 세포, 프로세스와 현재의 항원을 차지<sup> 6,7</sup>. CD40 – B 세포는 주요 순진하지에만 표시뿐만 아니라 메모리 T 세포를 확장했다<sup> 8,9</sup>. 따라서 CD40 – 활성 B 세포 (CD40 – B 세포)의 대체 소스로 연구되었습니다 단백질 stimulatory 항원 제시 세포 기반 immunotherapy1, 5,10를위한 세포 (APC)를. CD40 – B 세포가 생체내 효과적인 T 세포 반응을 유도하고 우리가 murine CD40 – 활성 B 세포의 생성을위한 세포 배양 시스템을 확립 기본 메커니즘을 연구 여부를 진학하기 위해서는. splenocytes를 사용하거나 CD40 – 정품 인증 C57BL / 6 마​​우스에서 B 세포를 정화, 최적의 조건은 다음과 같이 확인되었습니다 : C57BL / 6 마​​우스 (haplotype H – 2B) lymphocytes의 splenocytes의 시작은 밀도 기울기 원심 분리와 헬라와 함께 공동 양식에 의해 정화 아르 재조합 murine CD40 리간드 (tmuCD40L 헬라)를 표현 세포<sup> 11</sup>. 세포 3-4일 모든 recultured하고 같은 CD40L, 인터루킨 4와 같은 주요 구성 요소는 – 메르 캅 토 에탄올과 시클 로스 포린 A은 보충함 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 인간 CD40 – B 세포 (그림 1A, B)에 APC – 표현형 유사한 완벽하게 활성화 murine CD40 – B 세포 (mCD40B)을 구하는 방법을 보여줍니다. CD40 – 자극은 세포 배양 후 14 일 이내에 신속한 가지 고도 순수 (> 90%) CD19 + B 세포의 확장 (그림 1C, D)에 연결됩니다. 비 transfected 세포와 오염을 방지하려면 transfectants에 murine CD40 리간드 표현 (그림 2) 정기적으로 제어되어야한다. Murine CD40 – 활성 B 세포는 체외에서 생체내의 APC로 함수 자신의 잠재력을 조사하기 위해 B – 세포 활성화와 차별화뿐만 아니라 공부를하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그들은 종양에 대한 치료 또는 예방 접종을 수립을위한 유망한 도구를 대표하고 안전과이 방법의 immunogenicity에 관한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다<sup> 12</sup>.

Protocol

splenocytes에서 murine CD40 – 활성화된 B 세포 (mCD40B)의 생성을 위해 프로토콜은 두 부분으로 나누어져있다 : 부품으로 사용됩니다 판 – 헬라 세포 (tmuCD40L 헬라)를 표현 murine CD40 리간드 (CD40L)의 준비를 보여줍니다 피더 세포를 바운드. 파트 B는 실제 murine CD40 – B 문화를 설명합니다. 피더 세포의 A. 준비 (tmuCD40L 헬라) tmuCD40L 헬라 완전히 합류가해서는 안 자기편 ?…

Discussion

이 프로토콜의 수정은 특히도 murine CD40가 활성화된 B 세포의 효율적인 세대에 항복, CD40 – 자극 및 사용 마우스 변형의 유형의 기원에 대해 가능합니다. 아마디 외. CD40 – 리간드와 transfected murine 마우스 섬유아 세포에 대한 유사한 결과를 보여주었다. 외부의 항원이 맞는 프레 젠 테이션에서 확실하게 제외하지만, 보안 및 생체내의 독성에 관한 집중 연구는 인간의 transfected 헬라 세포를 사용?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 친절 tmuCD40 – 리간드 – 헬라 세포 라인을 제공 클레멘스 박사 Wendtner 감사합니다.

Materials

A. Preparation of Media:

Feeder cell wild type medium Feeder cell selection medium  
Reagent Concentration Reagent Concentration
RPMI 1640   RPMI 1640  
L-Glutamine 300 μg/mL L-Glutamine 300 μg/mL
FBS 10 % FBS 10 %
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
Gentamycin 15 μg/mL Gentamycin 15 μg/mL
   Hygromycin B 0.2 mg/mL
mCD40-B washing medium mCD40-B culture medium
Reagent Concentration Reagent Concentration
D-MEM
D-MEM
L-Glutamine 580 μg/mL L-Glutamine 580 μg/mL
Glucose 4.5 mg/mL Glucose 4.5 mg/mL
HEPES 10 mM HEPES 10 mM
Gentamycin 15 μg/mL Gentamycin 15 μg/mL


MEM 0.1mM (1x)


FBS 10%

B. Miscellaneous Reagents:

Reagent Company Order No
RPMI 1640 Invitrogen Gibco® REF 21875
D-MEM Invitrogen Gibco® REF 41965
Dulbecco´s PBS (10x) PAA Cat No H15-011
Gencin® Delta Select Art No 7395800
FBS LONZA Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Cat No S11-001
MEM NEAA Invitrogen Gibco® REF 11140
Hygromycin B PAA Cat No P02-015
Recombinant Murine Interleukin-4 Immunotools Cat No 12340045
Cyclosporin A Novartis Cat No NDC 0078-0109-01
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen Gibco® REF 15400-054

C. Miscellaneous Supplies:

Reagent Company Order No
Sterile pipette tips Sarstedt  
6-well plate NUNC Cat No 140675
50mL conical tube BD Falcon™ Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Cat No 83.1813.002

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
  2. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
  3. Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
  4. Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
  5. von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
  7. Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
  8. Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
  9. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
  10. Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
  11. Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
  12. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).

Play Video

Cite This Article
Liebig, T. M., Fiedler, A., Klein-Gonzalez, N., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. Murine Model of CD40-activation of B cells. J. Vis. Exp. (37), e1734, doi:10.3791/1734 (2010).

View Video