Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen
Summary
In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.
Abstract
Onderzoek naar de B-cellen heeft aangetoond dat CD40 activatie van hun antigeen presentatie vermogen verbetert. Wanneer gestimuleerd met interleukine-4 en CD40 ligand (CD40L), kunnen menselijke B-cellen worden uitgebreid zonder de moeilijkheden van kleine hoeveelheden van perifeer bloed binnen 14 dagen de tijd om zeer grote hoeveelheden van zeer zuivere CD40-B-cellen (> 10<sup> 9</sup> Cellen per patiënt) van gezonde donoren en patiënten met kanker<sup> 1-4</sup>. CD40-B-cellen express belangrijk lymfeklier homing moleculen en kan aantrekken T-cellen<em> In vitro</em<sup> 5</sup>. Verder zijn ze efficiënt opnemen, verwerken en presenteren antigenen aan T-cellen<sup> 6,7</sup>. CD40-B-cellen werd aangetoond dat niet alleen de prime naïef, maar ook uit te breiden geheugen T-cellen<sup> 8,9</sup>. Daarom is CD40-geactiveerde B-cellen (CD40-B-cellen) zijn bestudeerd als een alternatieve bron van immuno-stimulerende antigen-presenterende cellen (APC) voor cel-gebaseerde immunotherapy1, 5,10. Om verdere onderzoeken of CD40-B-cellen effectief T-cel responsen te induceren in vivo en de onderliggende mechanisme dat we een celcultuur ingevoerde systeem voor het genereren van muizen CD40-geactiveerde B-cellen te bestuderen. Met behulp van splenocyten of gezuiverd B-cellen van C57BL / 6 muizen voor CD40-activering, werden optimale condities geïdentificeerd als volgt: Vanaf splenocyten van C57BL / 6 muizen (haplotype H-2b) lymfocyten worden gezuiverd door dichtheidsgradiënt centrifugatie en co-gekweekt met HeLa cellen die recombinant muizen CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)<sup> 11</sup>. Cellen worden recultured elke 3-4 dagen en de belangrijkste componenten zoals CD40L, interleukine-4,-mercaptoethanol en ciclosporine A worden aangevuld. In dit protocol hebben we laten zien hoe je volledig geactiveerd muis CD40-B-cellen (mCD40B) te verkrijgen met vergelijkbare APC-fenotype van de menselijke CD40-B-cellen (Fig 1a, b). CD40-stimulatie leidt tot een snelle uitgroei en uitbreiding van zeer zuiver (> 90%) CD19 + B-cellen binnen 14 dagen na celkweek (afb. 1c, d). Om te voorkomen dat besmetting met niet-getransfecteerde cellen, expressie van de muizen-CD40-ligand op de transfectanten moet regelmatig worden gecontroleerd (afb. 2). Muizen CD40-geactiveerde B-cellen kunnen worden gebruikt voor het B-cel activatie en differentiatie, alsook onderzoek om hun potentieel te onderzoeken om te functioneren als APC in vitro en in vivo. Bovendien, zij vertegenwoordigen een veelbelovend instrument voor het vaststellen van de therapeutische of preventieve vaccinatie tegen tumoren en zal helpen om vragen met betrekking tot veiligheid en immunogeniciteit van deze aanpak te beantwoorden<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
Wijzigingen van dit protocol zijn mogelijk, vooral wat betreft de oorsprong van CD40-stimulus en het type muizenstam gebruikt, ook in waardoor een efficiënte generatie muizen CD40-geactiveerde B-cellen. Ahmadi et al.. hebben gelijkwaardige resultaten getoond voor muizen fibroblasten getransfecteerd met murine CD40-ligand. In deze context presentatie van xeno-antigeen kan met zekerheid worden uitgesloten, maar intensieve studies met betrekking tot de veiligheid en toxiciteit in vivo gaf geen tekenen van ontstek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Clemens Wendtner voor het aanbieden van tmuCD40-Ligand-HeLa cellijn.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
