Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu
Summary
Bu video, CD40 aktivasyonu ve dokunulmazlık indüksiyonu eğitim için bir model antijen sunan hücre (APC) olarak da kullanılabilir C57BL / 6 farelerin dalak, fare B hücreleri genişleme prosedürü göstermektedir.
Abstract
B hücreleri üzerinde araştırma CD40 aktivasyonu ve antijen sunumu kapasitesi iyileştirdiğini göstermiştir. Interlökin-4 ve CD40 ligand (CD40L) ile uyarıldığında, insan B hücreleri, 14 gün içinde son derece saf CD40-B hücreleri (çok büyük miktarda küçük miktarlarda periferik kan zorluklar olmadan açılabilir> 10<sup> 9</sup> Hasta başına kanser hastalarının yanı sıra sağlıklı donörlerin hücrelerinin)<sup> 1-4</sup>. CD40-B hücreleri önemli lenf nodu homing molekülleri ifade ve T hücreleri çekebilecek<em> In vitro</em<sup> 5</sup>. Ayrıca verimli T hücrelerine, süreç ve mevcut antijenlere kadar sürebilir<sup> 6,7</sup>. CD40-B hücreleri sadece başbakan naif değil gösterilen, aynı zamanda bellek T hücreleri genişletmek<sup> 8,9</sup>. Bu nedenle, CD40-aktive B hücreleri (CD40-B hücreleri) bir alternatif kaynak olarak çalışılmıştır immüno-uyarıcı hücre tabanlı immunotherapy1, 5,10 antijen sunan hücreler (APC). CD40-B hücreleri in vivo etkili T hücre yanıtları uyardığı ve fare CD40 aktive B hücreleri üretimi için bir hücre kültürü sistemi kurdu yatan mekanizma çalışma konusunda daha fazla çalışma için. Splenositlerin kullanılması veya CD40 aktivasyonu için C57BL / 6 fareler B hücreleri saflaştırılmış, optimal koşullar aşağıdaki gibi tespit edilmiştir: C57BL / 6 farelerinde (H-2b haplotip) lenfositler dalak itibaren yoğunluk gradiyenti santrifüj ve HeLa ile birlikte kültürlü arıtılmış rekombinant fare CD40 ligand (tmuCD40L HeLa) ifade hücreleri<sup> 11</sup>. Hücreler, 3-4 günde bir recultured ve CD40L, interlökin-4 gibi temel bileşenleri, mercaptoethanol ve siklosporin A takviye edilir. Bu protokolde insan CD40-B hücreleri (Şekil 1a, b) APC-fenotip benzer tam aktif fare CD40-B hücreleri (mCD40B) nasıl elde göstermektedir. CD40 stimülasyon hücre kültürü 14 gün içinde hızlı bir sonucudur ve yüksek saflıkta (>% 90) CD19 + B hücreleri genişleme (Şekil 1c, d) yol açar. -Transfekte olmayan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için, transfektanları fare CD40 ligand ekspresyonu (Şekil 2) düzenli olarak kontrol edilmesi. Murin CD40 aktive B hücreleri in vitro ve in vivo olarak APC olarak çalışması için kendi potansiyelini araştırmak için B-hücre aktivasyonu ve farklılaşması yanı sıra çalışma kullanılabilir. Ayrıca, tümörlere karşı tedavi veya önleyici aşı oluşturulması için umut verici bir aracı temsil eder ve bu yaklaşımın immünojenite ve güvenlik ile ilgili sorulara cevap vermeye yardımcı olacak<sup> 12</sup>.
Protocol
Discussion
Bu protokolün, özellikle de verimli nesil fare CD40-aktive B hücreleri verimli CD40-uyarıcı ve kullanılan fare gerginlik türü, kökeni ile ilgili Değişiklikler mümkündür. Ahmedi et al. CD40 ligand fare ile transfekte fare fibroblastlar için benzer sonuçlar vermiştir. Xeno-antijen Bu bağlamda sunumda kesin olarak hariç, ama güvenlik ve in vivo toksisite ile ilgili yoğun çalışmalar insan transfekte HeLa hücreleri kullanarak bu ayarı inflamasyon veya oto-bağışıklık reaksiyonu için hi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz lütfen Dr. Clemens Wendtner tmuCD40 Ligandla HeLa hücre hattı sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
A. Preparation of Media:
| Feeder cell wild type medium | Feeder cell selection medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 μg/mL | L-Glutamine | 300 μg/mL |
| FBS | 10 % | FBS | 10 % |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| Hygromycin B | 0.2 mg/mL |
| mCD40-B washing medium | mCD40-B culture medium | ||
| Reagent | Concentration | Reagent | Concentration |
| D-MEM | |
D-MEM | |
| L-Glutamine | 580 μg/mL | L-Glutamine | 580 μg/mL |
| Glucose | 4.5 mg/mL | Glucose | 4.5 mg/mL |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycin | 15 μg/mL | Gentamycin | 15 μg/mL |
| MEM | 0.1mM (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Miscellaneous Reagents:
| Reagent | Company | Order No |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco® | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco® | REF 41965 |
| Dulbecco´s PBS (10x) | PAA | Cat No H15-011 |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | LONZA | Cat No DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Cat No S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco® | REF 11140 |
| Hygromycin B | PAA | Cat No P02-015 |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 |
| Cyclosporin A | Novartis | Cat No NDC 0078-0109-01 |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen Gibco® | REF 15400-054 |
C. Miscellaneous Supplies:
| Reagent | Company | Order No |
| Sterile pipette tips | Sarstedt | |
| 6-well plate | NUNC | Cat No 140675 |
| 50mL conical tube | BD Falcon™ | Cat No 352070 |
| Tissue culture flask | Sarstedt | Cat No 83.1813.002 |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
