ヒト胚性幹細胞を凍結融解

1。解凍hES細胞プレ実験のセットアップ一日前に解凍hES細胞に、プレートMEF培地でゼラチンコート6ウエル組織培養プレート（D – MEM基礎培地を添加した1つのウェル上に照射したマウス胚性線維芽細胞（MEF）、CF1系統、のフィーダー層10％熱不活性化FBS、1％非必須アミノ酸）。 37℃および5％CO 2を一晩インキュベートする。 液体窒素からヒトES細胞を除去する前に、場所と効率的かつ成功した融解を確保するために使用する準備に必要なすべての機器と試薬を用意してください。 hES細胞を融解金属製のピンセットを用いて液体窒素貯蔵タンクからのヒトES細胞の極低温バイアルを取り外します。 霜を取り除くために3〜5秒のために手袋をはめた手の間にバイアルを転がし。 バイアルのラベルに情報を記録します。 金属製のピンセットを使用して、37℃の水浴中にバイアルを浸す。スワール優しくバイアルおよび氷結晶のサイズを確認するには、光にバイアルを保持することによって（ただしすぐに！）多くの場合、解凍の進行状況を観察。沈める水浴中でバイアルのキャップを、これは細胞を汚染する可能性として使用しないでください。 唯一の小さな氷の結晶が残っている、水没殺菌にエタノールで全体バイアル。 無菌生物学的安全キャビネット内で、15 mLコニカルチューブの底に直接低温バイアルの内容を転送します。 徐々にヒトES細胞培養培地を4mL（20％ノックアウト血清代替物、1％非必須アミノ酸、1％L -グルタミン、0.2％β-メルカプトエタノール、4 ngの/を補充D-MEM/F-12基礎培地を追加するチューブへの添加のbFGF）。ゆっくりと新しいメディアがチューブに追加されるよう継続的に細胞を混合して揺らし。 200 × gで5分間、細胞を遠心分離 hES細胞をめっき細胞株、継代数、および融解日付：ヒトES細胞は遠心分離している一方で、適切​​なhES細胞の情報で標識することにより、MEFフィーダープレートを準備。 スピン時に残された約2分がある場合には、MEFの培地を吸引し、ウェルにPBS 1.0 mLを加える。 生物学的安全キャビネットに戻ってペレット化hES細胞を持参し、慎重に上清を吸引除去する。細胞ペレットを吸引しますが、このソリューションは凍結培地からDMSOが含まれているように、上清をできるだけ削除しないように注意してください。 ペレットは、5 mLのガラスピペットを用いてヒトES細胞培養の培地2.5 mLを加えると3-4回ピペッティングして、非常に穏やかに再懸濁する。 よくMEFフィーダーからPBSを吸引除去し、徐々に6ウェルプレートのウェル準備するためにヒトES細胞懸濁液のすべての2.5 mlを加える。 37℃のインキュベーターにプレートを置き、慎重に均等によく中の細胞を配布する側にバックアップするために前方にプレート、そして側面をスライドさせます。中央のコロニーを集中避けるために、円を描くように旋回プレートをしないでください。 細胞は37℃、一晩5％CO 2を添付することができます。 雪解け後の日、培地を除去（あらゆる浮遊細胞を使用）と同様に新鮮なhES細胞の培養液の2.5 mlを加える。 オプション：削除された培地と細胞が別々の準備MEFフィーダープレートに転送することができます。このステップでは、多くの場合、元の融解から細胞と並行して培養することができる新たなコロニーを生成します。 37℃、5％CO 2で一晩培養する。 2。 hES細胞の凍結ヒトES細胞は遠心分離されている間、細胞株、継代数、および凍結日付を含む生物学的安全キャビネット内部の極低温バイアルを、ラベルを付けます。凍結ヒトES細胞の典型的な密度は、極低温バイアル当たりの細胞の1つのウェル（6ウェルプレートから）です。 ヒトES細胞を遠心分離が終了したら、生物学的安全キャビネットにチューブを戻す。ゆるく充填された細胞ペレットを乱さないように注意しながら、チューブから上清を吸引除去する。 極低温バイアルあたり0.5mLのヒトES細胞培養用培地：ヒトES細胞培養培地の適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。 hES細胞は、比較的大きなコロニーの部分で凍結時より回復として、ピペッティング時に非常に穏やかである。 ゆっくり、静かにチューブを振とうしながら、細胞に2XヒトES細胞凍結培地の適切な量（クライオバイアルあたり0.5mL）を（FBS、20％ヒトES細胞培養培地、および20％DMSO定義されている60％）を加える。一度凍結培地をピペットで混合するために1〜2回は非常に優しく、ソリューションに追加されます。 迅速かつ慎重に、各極低温バイアルに細胞懸濁液1 mLを加える。 のイソプロパノール冷凍コンテナと所定の位置にバイアルを移す-80℃冷凍庫で一晩。細胞は、1 ° Cイソプロパノール冷凍コンテナで毎分フリーズします。 翌日、すぐに金属製のピンセットを用いて液体窒素貯蔵タンクに凍結バイアルを移す。 代表的な結果ヒトES細胞を融解している最初の日の後、小さなコロニーが透明に表示されることがありますし、顕微鏡下で確認することが困難な場合があります。新たに融解したES細胞はゆっくり増殖する傾向があるので、彼らは確立されたコロニー（図1）として表示されるまで数日かかることがあります。 図1。液体窒素から解凍した細胞の回復と成長。hES細胞は、撮像した 1、解凍後7および11日間。