تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

1. ذوبان الخلايا HES قبل انشاء التجريبية قبل يوم واحد لخلايا HES ذوبان الجليد ، لوحة طبقة من الخلايا الليفية التغذية الماوس الجنينية المشع (MEF) ، CF1 سلالة ، وكذلك على واحد من الجيلاتين المغلفة جيدا 6 – نسيج لوحة الثقافة في مستنبت MEF (D MEM المتوسطة تستكمل مع القاعدية 10 ٪ الحرارة المعطل FBS و 1 ٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية). يحضن بين عشية وضحاها على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. قبل إزالة الخلايا HES من النتروجين السائل ، يجب التأكد من أن جميع المعدات اللازمة والكواشف في مكان وعلى استعداد لاستخدامها لضمان وجود تحسن كفاءة ونجاحا. ذوبان للخلايا HES إزالة القارورة المبردة من الخلايا HES من خزان النتروجين السائل التخزين باستخدام الملقط المعدني. لفة القارورة بين يدي القفاز لمدة 3-5 ثانية لإزالة الصقيع. تسجيل المعلومات على التسمية من القارورة. باستخدام الملقط المعدني ، اغمس القارورة في حمام ماء C ° 37. دوامة القارورة بلطف ومراقبة التقدم المحرز في ذوبان الجليد في كثير من الأحيان (ولكن بسرعة!) من خلال عقد القارورة إلى الضوء لمعرفة حجم الكريستال الجليد. لا تغمره غطاء قنينة من الماء في الحمام لأن ذلك قد يلوث الخلايا. فقط عندما بلورة الجليد الصغيرة لا تزال ، يغرق القنينة بأكملها في الايثانول لتعقيم. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، ونقل محتويات القارورة المبردة مباشرة إلى أسفل أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة ببطء 4 مل من خلية HES مستنبت (D-MEM/F-12 المتوسطة القاعدية تستكمل مع خروج المغلوب استبدال 20 ٪ المصل ، 1 ٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 1 ٪ L – الجلوتامين ، 0.2 ٪ β – المركابتويثانول و 4 نانوغرام / bFGF مل) في أنبوب. بلطف لمزج موسيقى الروك باستمرار الخلايا كما يتم إضافة هذه الوسيلة الجديدة للأنبوب. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غرام × 200 طلاء للخلايا HES في حين أن خلايا HES في جهاز الطرد المركزي ، وإعداد لوحة العلامات التي المغذية MEF مع المعلومات المناسبة الخلية HES : خط الخلية ، ورقم المرور ، وتاريخ ذوبان الجليد. عندما يكون هناك ما يقرب من 2 دقائق من انتهاء الوقت على زيادة ونقصان ، ونضح مستنبت MEF وإضافة 1.0 مل من برنامج تلفزيوني إلى البئر. تقديم مكعبات الخلايا HES يعود الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، ونضح بعناية طاف. يجب الحرص على عدم نضح الخلية بيليه ، ولكن كما طاف إزالة أكبر قدر ممكن ، وهذا الحل يتضمن DMSO المتوسطة من التجمد. إعادة تعليق بيليه بلطف جدا عن طريق إضافة 2.5 مل من خلية HES مستنبت زجاجي باستخدام الماصة 5 مل وpipetting 3-4 مرات. نضح في برنامج تلفزيوني من وحدة التغذية MEF جيدا وإضافة ببطء كل ​​مل 2.5 من نظام التعليق الخلية HES للاستعداد جيدا لوحة 6 – جيدا. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية والشريحة بعناية لوحة الأمام إلى الخلف ، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي على الخلايا في جميع أنحاء البئر. دوامة لا لوحة في نمط دائري لتجنب التركيز على المستعمرات في المركز. السماح للخلايا لنعلق على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 بين عشية وضحاها. بعد يوم من ذوبان الجليد ، وإزالة المتوسطة (مع أية خلايا التعويم) وإضافة 2.5 مل من خلية جديدة HES مستنبت إلى البئر. اختياري : يمكن نقل المتوسطة وإزالة الخلايا لوحة منفصلة أعدت MEF المغذية. هذه الخطوة بإنشاء مستعمرات جديدة في كثير من الأحيان يمكن أن يكون المثقف بالتوازي مع الخلايا من ذوبان الجليد الأصلي. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 بين عشية وضحاها. 2. تجميد خلايا HES في حين أن خلايا HES هي في أجهزة الطرد المركزي ، تسمية قارورة المبردة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، بما في ذلك خط الخلية ، ورقم المرور ، وتاريخ التجميد. كثافة نموذجي للخلايا HES تجميد هي واحدة من الخلايا بشكل جيد (من لوحة 6 أيضا) في القارورة المبردة. عندما يتم الانتهاء من الخلايا HES الطرد المركزي ، ليصبح أنابيب العودة الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. وطاف نضح من الأنبوب ، والحرص على عدم تعكير صفو فضفاضة معبأة الخلية بيليه. Resuspend بيليه في الخلية التي تحتوي على كمية مناسبة من خلية HES مستنبت : 0.5 مل الخلية HES مستنبت في القارورة المبردة. أن يكون لطيف للغاية عندما pipetting ، والخلايا على نحو أفضل عندما HES استرداد القطع المجمدة في مستعمرة كبيرة نسبيا. ببطء ، في حين تهز برفق الأنبوب ، إضافة إلى مبلغ مناسب (0.5 مل لكل cryovial) من الخلية 2X HES تجميد المتوسطة (60 ٪ FBS محددة ، و 20 ٪ ثقافة الخلية HES المتوسطة ، و 20 ٪ DMSO) إلى الخلايا. بمجرد إضافة المتوسطة التجميد ، الماصة الحل بلطف بالغ 1-2 مرات لالمزيج. بسرعة ولكن بلطف ، إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق كل قارورة المبردة. نقل قوارير في وعاء تجميد الأيزوبروبانول ووضعه فيa المجمد -80 درجة مئوية خلال الليل. سيتم تجميد الخلايا في 1 درجة مئوية في الدقيقة الواحدة في حاوية تجميد الأيزوبروبانول. في اليوم التالي ، ونقل بسرعة القنينات المجمدة إلى خزان النتروجين السائل التخزين باستخدام الملقط المعدني. ممثل النتائج في اليوم الأول بعد إذابة الخلايا ES الإنسان ، قد مستعمرات صغيرة شفافة وتظهر قد يكون من الصعب أن نرى تحت المجهر. منذ خلايا ES إذابة حديثا تميل إلى تتكاثر ببطء ، فإنها قد يستغرق بضعة أيام لتظهر كما أنشأت مستعمرات (الشكل 1). الشكل 1. وقد التقط الانتعاش والنمو الخلية. إذابة الخلايا HES من النيتروجين السائل 1 و 7 و 11 يوما بعد الذوبان.