Congelamento e scongelamento cellule staminali embrionali umane

1. Scongelamento hES cellule Pre-set-up sperimentale Un giorno prima di scongelare le cellule hES, piatto uno strato alimentatore di fibroblasti di topo irradiati embrionali (MEF), CF1 sforzo, da un pozzetto di una gelatina rivestite 6 e piastra di coltura tissutale nel terreno di coltura MEF (D-MEM medio basale integrato con 10% di siero FBS e 1% di aminoacidi non essenziali). Incubare per una notte a 37 ° C e 5% di CO 2. Prima di rimuovere le cellule hES da azoto liquido, essere sicuri di avere tutte le attrezzature necessarie e reagenti a posto e pronti da utilizzare per garantire un disgelo efficiente e di successo. Scongelamento delle Cellule hES Rimuovere una fiala criogenico di cellule hES dal serbatoio di stoccaggio di azoto liquido con pinze di metallo. Stendere la fiala tra le mani guantate per 3-5 secondi per rimuovere il gelo. Registrare le informazioni sull'etichetta del flaconcino. Utilizzando pinze di metallo, immergere il flacone in un bagno d'acqua a 37 ° C. Ruotare delicatamente il flaconcino e osservare i progressi del disgelo spesso (ma velocemente!) Tenendo il flacone fino alla luce per vedere le dimensioni del cristallo di ghiaccio. Non immergere il tappo del flacone nel bagno d'acqua in quanto ciò potrebbe contaminare le cellule. Quando solo un cristallo di ghiaccio rimane piccolo, immergere la fiala intera in etanolo per sterilizzare. In un armadio di sicurezza biologica sterile, trasferire il contenuto della fiala criogenico direttamente al fondo di un tubo da 15 ml. Lentamente aggiungere 4 ml di terreno di coltura cellulare hES (D-MEM/F-12 medio basale completato con la sostituzione Knockout 20% siero, 1% di aminoacidi non essenziali, 1% di L-glutammina, 0,2% β-mercaptoetanolo e 4 ng / ml bFGF) al tubo. Scuotere delicatamente per mescolare continuamente le cellule come il nuovo mezzo si aggiunge al tubo. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 x g. Placcatura Celle hES Mentre le cellule hES sono nella centrifuga, preparare il piatto alimentatore MEF, mediante l'etichettatura con l'apposito info cella hES: linea cellulare, il numero di passaggio, e la data disgelo. Quando vi è di circa 2 minuti dalla fine del periodo di rotazione, aspirare il terreno di coltura MEF e aggiungere 1,0 ml di PBS al pozzo. Portare le cellule pellet hES torna alla cappa di sicurezza biologica, e con attenzione aspirare il surnatante. Fare attenzione a non aspirare il pellet, ma rimuovere il più surnatante possibile, in quanto questa soluzione contiene DMSO dal mezzo di congelamento. Risospendere il pellet molto delicatamente con l'aggiunta di 2,5 ml di terreno di coltura cellulare hES utilizzando una pipetta di vetro 5 ml e pipettare 3-4 volte. Aspirare il PBS dall'alimentatore MEF bene e aggiungere lentamente tutti i 2,5 ml di sospensione cellulare hES al preparato bene del 6 pozzetti. Collocare la piastra nel 37 ° C incubatore e con attenzione scorrere la piastra in avanti a indietro, e un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule in tutto il bene. Non agitare il piatto in un modello circolare per evitare di concentrare le colonie al centro. Permettono alle cellule di fissare a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte. Il giorno dopo il disgelo, rimuovere il supporto (con eventuali cellule galleggiante) e aggiungere 2,5 ml di fresca terreno di coltura cellulare hES al pozzo. Opzionale: Il mezzo rimosso e le cellule possono essere trasferiti su un piatto preparato alimentatore separato MEF. Questa operazione genera spesso nuove colonie che può essere coltivato in parallelo con le cellule dal disgelo originale. Incubare le piastre a 37 ° C di CO 2 e il 5% durante la notte. 2. Congelamento delle Cellule hES Mentre le cellule hES sono nella centrifuga, etichetta le fiale criogenica all'interno della cappa di sicurezza biologica, inclusa la linea cellulare, il numero di passaggio, e la data di congelamento. La densità tipica per il congelamento delle cellule hES è un pozzo di cellule (da una a 6 pozzetti) per flaconcino criogenico. Quando le cellule sono finiti hES centrifugazione, portare i tubi dietro alla cappa di sicurezza biologica. Aspirare il surnatante dal tubo, facendo attenzione a non disturbare il vagamente ricco di pellet. Risospendere il pellet cellulare con la giusta quantità di terreno di coltura cellulare hES: 0,5 ml di cellule hES terreno di coltura per flaconcino criogenico. Siate molto gentile durante il pipettaggio, come le cellule hES recuperare meglio se congelati in pezzi colonia relativamente grandi. Lentamente, mentre scuotendo leggermente il tubo, aggiungere la giusta quantità (0,5 ml per provetta Microbank ™) di media 2X congelamento delle cellule hES (60% FBS definito, il 20% delle cellule hES terreno di coltura, e il 20% DMSO) per le cellule. Una volta che il medium di congelamento è aggiunto, pipetta la soluzione estrema dolcezza 1-2 volte per mescolare. Rapidamente, ma delicatamente, aggiungere 1 ml di sospensione cellulare per ogni flacone criogenici. Trasferire le provette in un contenitore congelamento isopropanolo e posto inuno congelatore -80 ° C durante la notte. Le cellule si blocca a 1 ° C al minuto nel contenitore congelamento isopropanolo. Il giorno seguente, trasferire rapidamente le fiale congelato in un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido con pinze di metallo. Rappresentante Risultati Il primo giorno dopo cellule staminali embrionali umane sono scongelati, piccole colonie possono apparire trasparente e può essere difficile da vedere sotto il microscopio. Dato che le cellule ES appena scongelati lentamente tendono a proliferare, possono richiedere qualche giorno di apparire come stabilito colonie (Figura 1). Figura 1. Il recupero e la crescita cellulare. Cellule hES scongelato da azoto liquido sono stati imaged Giorni 1, 7 e 11 dopo lo scongelamento.