Invriezen en ontdooien van menselijke embryonale stamcellen

1. Ontdooien hES cellen Pre-experimentele set-up Een dag voorafgaand aan het ontdooien hES cellen, plaat een voedingsbodem van bestraalde muis embryonale fibroblasten (MEF), CF1 stam, op een goed van een gelatine-gecoate 6-well weefselkweek plaat in MEF kweekmedium (D-MEM basaal medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS en 1% niet-essentiële aminozuren). Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2. Voordat u de hES cellen van vloeibare stikstof, moet u alle benodigde apparatuur en reagentia zijn in plaats en klaar voor gebruik om een ​​efficiënte en succesvolle dooi te verzekeren. Ontdooien van de hES cellen Verwijderen van een cryogene flacon van hES cellen van de vloeibare stikstof opslag tank met behulp van metalen tang. Rol de flacon tussen gehandschoende handen gedurende 3-5 seconden ingedrukt om de vorst te verwijderen. Noteer de gegevens op het etiket van de flacon. Met behulp van metalen tang, dompel de flacon in een 37 ° C waterbad. Zwenk de flacon voorzichtig en vaak houden aan de voortgang van de dooi (maar snel!) Door houden de flacon tegen het licht om de grootte van het ijs kristal. Niet onderdompelen de dop van de flacon in het waterbad, omdat dit zou kunnen verontreinigen van de cellen. Wanneer slechts een klein ijskristal blijft, dompel de gehele flacon in ethanol om te steriliseren. In een steriele biologische veiligheid kast, breng de inhoud van de cryogene flacon direct naar de bodem van een 15 ml conische buis. Voeg langzaam 4 mL van hES celkweekmedium (D-MEM/F-12 basaal medium aangevuld met 20% Knockout serum vervanging, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine, 0,2% β-mercapto-ethanol en 4 ng / mL bFGF) op de buis. Schud om voortdurend mixen de cellen als het nieuwe medium wordt toegevoegd aan de buis. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g. Plating de HES Cellen Terwijl de hES cellen in de centrifuge, de voorbereiding van de MEF feeder plaat door middel van etikettering met de juiste hES cell informatie: cellijn, passage nummer, en ontdooien datum. Wanneer er sprake is ongeveer 2 minuten op de spin tijd, zuigen de MEF kweekmedium en voeg 1,0 mL PBS aan de put. Breng het ingehulde hES cellen om de biologische veiligheid kabinet, en zorgvuldig aspireer het supernatant. Wees voorzichtig niet naar de cel pellet aspireren, maar verwijder zoveel supernatant als mogelijk, omdat deze oplossing bevat DMSO uit de bevriezing medium. Resuspendeer de pellet heel voorzichtig door het toevoegen van 2,5 mL van HES celkweekmedium met behulp van een 5 ml glazen pipet en pipetteren 3-4 keer. Zuig het PBS van de MEF feeder goed en langzaam alle 2,5 mL van de HES celsuspensie toe te voegen aan de voorbereide goed van de 6-wells plaat. Plaats de plaat in de 37 ° C incubator en zorgvuldig de plaat naar voren naar achteren en opzij schuif naar rechts gelijkmatig te verdelen de cellen gedurende de put. Niet krul de plaat in een cirkelvormig patroon om te voorkomen dat het concentreren van de kolonies in het centrum. Laat de cellen te hechten bij 37 ° C en 5% CO 2 's nachts. De dag na de dooi, verwijder het medium (met een drijvend cellen) en voeg 2,5 ml vers hES celkweekmedium naar de waterput. Optioneel: De verwijderde medium en cellen kunnen worden overgebracht naar een afzonderlijk bereid MEF feeder plaat. Deze stap levert vaak nieuwe kolonies die kunnen worden gekweekt in parallel met cellen van de oorspronkelijke dooi. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO 2 's nachts. 2. Het bevriezen van de hES cellen Terwijl de hES cellen in de centrifuge, het etiket van de cryogene flacons in de biologische veiligheid kabinet, inclusief de cellijn, passage nummer, en invriezen datum. De typische dichtheid voor het bevriezen van hES cellen is een bron van cellen (van een 6-wells plaat) per cryogene flacon. Wanneer de hES cellen klaar centrifugeren, terug te brengen van de buizen naar de biologische veiligheid kabinet. Zuig het supernatans van de buis, zorg dat u de los-packed cell pellet te verstoren. Resuspendeer de celpellet met de juiste hoeveelheid van HES celkweekmedium: 0,5 ml hES celkweekmedium per cryogene flacon. Wees zeer voorzichtig bij het pipetteren, zoals de hES cellen beter herstellen wanneer ingevroren in relatief grote kolonie stukken. Langzaam, terwijl zachtjes de buis te schudden, voeg de juiste hoeveelheid (0,5 ml per cryovial) van 2X hES cell bevriezing medium (60% gedefinieerd FBS, 20% hES celkweekmedium, en 20% DMSO) naar de cellen. Zodra de bevriezing medium wordt toegevoegd, de oplossing pipet uiterst voorzichtig een tot twee keer om te mixen. Snel, maar zacht, voeg 1 ml van de celsuspensie aan elke cryogene flacon. Breng de injectieflacons in een isopropanol bevriezing container en plaats in deeen -80 ° C vriezer gedurende de nacht. De cellen zullen bevriezen op 1 ° C per minuut in de isopropanol bevriezing container. De volgende dag, snel overdracht van de bevroren flesjes naar een vloeibare stikstof opslagtank met metalen tang. Representatieve resultaten De eerste dag na menselijke embryonale stamcellen ontdooid zijn, kunnen kleine kolonies lijken transparant en kan moeilijk te zien onder de microscoop. Omdat nieuw ontdooid ES-cellen hebben de neiging om langzaam te verspreiden, kunnen zij een paar dagen te verschijnen, zoals vastgesteld kolonies (figuur 1). Figuur 1. Cel herstel en groei. HES cellen ontdooid van vloeibare stikstof werden afgebeeld 1, 7 en 11 dagen na het ontdooien.