זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T

הכנת ריאגנטים הפוך חוצץ המכיל PBS עם ארגון ה-BSA (0.5%), ו – 2 mM EDTA. בגלל בועות אוויר יכול לחסום MACS עמודות הפרדה, המאגר צריך להיות degassed ומאוחסנים ב 2-8 מעלות לפני השימוש. אנו משתמשים RPMI 1640 בינוני המכילה סרום עכבר 5%. בינוני תרבות לא יכילו BSA או FCS, כמו תרכובות אלו תשנה את הספציפיות של גירוי התאים. IL-17 עכבר Assay הפרשת – העשרה תא ערכת זיהוי מ-Miltenyi BIOTEC. הערכה מכילה את הרכיבים הבאים: IL-17 מגיב תפוס, IL-17 נוגדן איתור (ביוטין), Anti-ביוטין-PE, ו Anti-PE microbeads. גירוי Splenocytes פרוטוקול זה מתבצע בנוכחות של פקד שליליות וחיוביות, כגון splenocytes unstimulated ו counterstain עבור ותאי T. פרוטוקול זה מבוצעת באמצעות טכניקה סטרילית. הכן ההשעיה תא בודד של העכבר splenocytes שהיו מבודדים באמצעות Dissociator ™ gentleMACS. ריכוז של תאים צריך להיות קבוע מראש באמצעות ספירת התאים. גלולה התאים ב × 200 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant את גלולה באמצעות פיפטה. אין למזוג את הצינור כדי למנוע אובדן של גלולה. עכשיו, resuspend התאים במדיום תרבות ולאחר מכן להוסיף את באר. הוסף בינוני מספיק ריכוז של 10,000,000 תאים לכל מ"ל ו – 5,000,000 תאים לס"מ מרובע. כדי לעורר תגובה חיסונית בתאי resuspended שלנו, אנו להוסיף ionomycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) ו PMA (10 ng / mL) המדגם ומערבבים את הפתרון על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. ואז בארות מסומנים בהתאם. עכשיו, אנו דגירה התאים שלנו במשך 3 שעות ב 37 ° C, ללא ערבוב כדי להתחיל את תקופת גירוי. המשך IL-17 3 שעות מתחילת הניתוח של גירוי, ולכן התוכנית בהתאם. כדי לעצור את הפרשה, התאים ממוקמים על קרח אנו אוספים את התאים מגורה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עם חיץ קר. תאים מועברים לאחר מכן מהבאר אל צינור ו נשטפים בפעם השנייה. על מנת להבטיח כי כל התאים נאספים, זה רעיון טוב כדי לבדוק המנה שלך תחת מיקרוסקופ. אם התאים עדיין להישאר מחובר, אתה יכול לאסוף את התאים הנותרים על ידי שטיפת צלחת עם חיץ קר. גושים כל תא ההשעיה הסלולרי שלך ניתן להסיר באמצעות טרום הפרדה מסננים. סימון תאים עם מגיב תפוס זה הוא בעל חשיבות עליונה לציין, כי assay זה עובד באופן אופטימלי אם פחות מ 2% של IL-17-מפריש תאים קיימים. אם ריכוז של IL-17 תאים להפריש צפוי להיות יותר מ 2% להתאים כמויות בהתאם. מכשול אפשרי אחד של הליך זה הוא זיהום לחצות של מגיב תפוס, אשר יכול להתרחש במהלך תיוג כאשר נוגדן ספציפי דו נקשר לתא להפריש ללא טי ומלכודות IL-17 מופרש מן לימפוציטים שכנה, ובכך לייצר תוצאות חיוביות שגויות. כדי לעקוף בעיה זו, חשוב לתאי להתקרר לפני תיוג לעבוד עם חיץ קר להאט דיפוזיה של IL-17 ו להימנע זיהום לחצות. בנוסף לשמירה על התאים קר, הם חייבים להיות כל הזמן בריכוז מוגדר. כדי להתחיל את ההליך תיוג, אנו משתמשים 10,000,000 תאים צינור closable 15 מ"ל. אם המספרים גבוהים יותר התא צריך להיות בשימוש, פשוט בקנה מידה את כל הכרכים בהתאם. לאחר ריכוז אופטימלי תא התקבל, לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ קר. ספין למטה התאים ב 300 × גרם במשך 10 דקות בצנטריפוגה בקירור (2-8 מעלות צלזיוס). בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant לחלוטין בעזרת פיפטה. אין למזוג supernatant כמו זה יוביל לאובדן התא כרכים מדויק. חזור על השלב כביסה אשר מורכב הוספת 10 מ"ל של חיץ צנטריפוגה קור, והשאיפה. עכשיו יש לנו גלולה של טוהר הרצוי, resuspend התאים μL 80 של המדיום תרבות קר. לתייג אותם, נוכל כעת להוסיף 20 μL של מגיב עכבר IL-17 תפוס. דגירה התאים למשך 5 דקות על הקרח. לאחר תקופת דגירה 5 דקות על הקרח, להסיר את הצינור לדלל את התאים 10 מ"ל של מדיום 37 מעלות צלזיוס חם. ואז לאבטח את הצינור על Rotator Tube MACSmix ו דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות תחת תנועה רציפה. הגדלת הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס יהיה להתחיל מחדש הפרשת ציטוקינים. סימון תאים עם נוגדן IL-17 Detection (ביוטין) ו Anti-ביוטין-PE לאחר תקופת הפרשת 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, במקום צינור מיד על הקרח. זה יעצור הפרשת ציטוקינים. מכאן ואילך זה קריטי לשמור על התאים על הקרח.עבודה עם חוצץ קר ימנע זיהום לחצות של מגיב תפוס. מלאו את הצינור עם חיץ צנטריפוגות קר בבית 300xg ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין. חזור על לשטוף את השלב עוד פעם אחת. גלולה התא resuspended ב 80 μL של חיץ קר הצינור ממוקם על הקרח. כדי למנוע מחייב נוקבים של הנוגדן, אנו ממליצים על תוספת של מגיב FCR 10μl חסימת לדגור על קרח דק '5. אז נוסיף 20 μL של נוגדן עכבר IL-17 Detection (ביוטין) כי הוא מצומדות כדי ביוטין ו דגירה במשך 10 דקות על הקרח. שוב, לשטוף תאים כפי שעשינו לפני כן על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ צנטריפוגות קר בבית 300xg ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. עכשיו לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 80 של המאגר הקר. הוסף 20 μL של נוגדנים משני שלנו, Anti-ביוטין-PE. מערבבים את התאים פתרון נוגדנים משנית, ושוב דגירה הצינור במשך 10 דקות על הקרח. ברגע זה הדגירה השני הוא מלא, לשטוף את התאים עם חיץ 10 מ"ל ו – קר צנטריפוגות. גלולה כעת ניתן resuspended ב μL 500 של המאגר הקר. אם התאים יש להפריד לניתוח נוסף במורד הזרם, הם יכולים להיות מתויג מגנטית עם Anti-PE-microbeads ומופרד באופן ידני או אוטומטי באמצעות MACS עמודות מפרידים MACS. השלמנו עתה את התוויות של splenocytes והם מוכנים לניתוח. FACS ניתוח לניתוח שלנו, נוכל להשוות את splenocytes מגורה unstimulated ידי cytometry הזרימה. לפני ניתוח תזרים cytometric, התאים הם מוכתמים יודיד propidium על 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לשער את התאים המתים. Analyzer ™ MACSQuant היתה עמוסה 200,000 תאים עבור כל דגימה ואנחנו עכשיו הולכים להסתכל על מגרשים פיזור של תגובתיות נוגדן יחסית הדגימות. שני השיקולים החשובים לניתוח של תאים נדירים – כמו IL-17 תאים חיובית – ידי זרימת cytometry הם: קביעת השער על הלימפוציטים פיזור קדימה לעומת פיזור העלילה בצד ו gating את התאים המתים (מוכתמים propidium יודיד) ו-B-תאים (אשר עלול לגרום מכתים רקע נוקבים) כדי לשפר עוד יותר את הרגישות של זיהוי השתמשנו CD4-APC נוגדנים ותאי T לזהות את הנוגדן CD45R/B220-PerCP לזהות את התאים B. אנו רואים את המאפיינים פיזור קדימה בצד של הדגימות ולהחיל השער על אוכלוסיית הלימפוציטים. השער השני היה ליישם כדי לראות את התאים המתים מוכתם ותאי B מוכתם (ציר Y). תאים אלה אינם נכללים בניתוח תא T. בדוגמה זו, אשר היא למעשה שליטה שלילית שלנו, אנו יכולים לראות כי יש מעט מאוד IL-17 CD4 מפריש תאים חיובית T בדגימות unstimulated כ – 0.003% (איור 4). כאשר מסתכלים על האוכלוסייה מגורה תא T, אנו יכולים לראות מספר לא מבוטל של CD4 חיובי תאי T להפריש IL-17 – על 0.367% (איור 5A) לפני ההפרדה 60.76% לאחר הפרדה מגנטי עם MACS וטכנולוגיה (איור 5 ב).