Detektion und Isolation von lebensfähigen Maus IL-17-sezernierenden T-Zellen

Vorbereitung der Reagenzien Machen Sie einen Puffer mit PBS mit BSA (0,5%) und 2 mM EDTA. Da Luftblasen MACS Trennsäulen Block kann, muss der Puffer entgast und bei 2-8 ° C vor Gebrauch gespeichert werden. Wir verwenden RPMI 1640 Medium mit 5% Maus-Serum. Das Kulturmedium sollte nicht enthalten BSA oder FCS, da diese Verbindungen wird die Besonderheit des Zell-Stimulation verändern. Die Maus IL-17 Sekretion Assay – Cell Enrichment and Detection Kit von Miltenyi-Biotec. Das Kit enthält folgende Komponenten: der IL-17 Catch-Reagenz, das IL-17 Detection Antibody (Biotin), die Anti-Biotin-PE, und die Anti-PE MicroBeads. Förderung der Milzzellen Dieses Protokoll ist in der Gegenwart eine negative und positive Kontrolle, wie unstimulierten Splenozyten und eine Gegenfärbung für T-Zellen durchgeführt. Dieses Protokoll wird mit einer sterilen Technik durchgeführt. Bereiten Sie eine einzelne Zelle Aussetzung der Maus-Splenozyten, dass isolierte Verwendung des gentleMACS ™ Dissociator wurden. Die Konzentration der Zellen sollte über Zellzählung vorgegeben werden. Pellet die Zellen bei 200 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation absaugen der Überstand der Pellet mit einer Pipette. Nicht dekantieren das Rohr, um den Verlust des Pellets zu vermeiden. Nun, die Zellen in das Kulturmedium und fügen Sie dann zu einem Brunnen. Fügen Sie ausreichend Medium für eine Konzentration von 10 Millionen Zellen pro ml und fünf Millionen Zellen pro Quadratzentimeter. Zur Stimulierung einer Immunantwort in unserer resuspendierten Zellen, fügen wir Ionomycin (1 pg / ml) und PMA (10 ng / mL) zur Probe und mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Dann wird der Brunnen sind entsprechend gekennzeichnet. Jetzt werden wir unsere Zellen für 3 Stunden bei 37 ° C ohne Mischen auf die Stimulation Periode beginnen. Fahren Sie mit IL-17-Analyse 3 Stunden ab Einsetzen der Stimulation, so entsprechend planen. So stoppen Sie die Sekretion werden die Zellen auf Eis gelegt, und wir sammeln die stimulierten Zellen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit kaltem Puffer. Die Zellen werden dann aus dem Brunnen zu einem Röhrchen überführt und gewaschen werden, ein zweites Mal. Um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt sind, ist es eine gute Idee, Ihr Gericht unter einem Mikroskop zu überprüfen. Wenn Zellen immer noch verbunden bleiben, können Sie die restlichen Zellen durch Spülen der Teller mit kaltem Puffer zu sammeln. Jede Zellklumpen in ihrer Zellsuspension kann mit Hilfe der Pre-Trennfilter werden. Labeling der Zellen mit Catch Reagent Es ist äußerst wichtig zu beachten, dass dieser Test optimal funktioniert, wenn weniger als 2% der IL-17-sezernierenden Zellen vorhanden sind. Wenn die Konzentration von IL-17 sezernierenden Zellen wird erwartet, dass mehr als 2% einstellen Volumina entsprechend. Eine mögliche Fehlerquelle dieses Verfahrens ist eine Kreuzkontamination von der Catch Reagent, die beim Etikettieren auftreten können, wenn die bi-spezifische Antikörper bindet an ein nicht-sezernierenden T-Zellen und Fallen IL-17 aus einem benachbarten Lymphozyten sezerniert wird, um dadurch Fehlalarme. Um dieses Problem zu umgehen, ist es wichtig, kühlen Zellen nach unten vor der Markierung und die Arbeit mit kaltem Puffer zur Verbreitung von IL-17 langsam und vermeiden Kreuzkontamination. Zusätzlich zu halten die Zellen kalt, müssen sie bei einer definierten Konzentration gehalten werden. Zu Beginn der Kennzeichnung Verfahren verwenden wir 10 Millionen Zellen in einer 15 ml Tube verschließbar. Werden höhere Zellzahlen verwendet werden müssen, einfach skalieren alle Volumes entsprechend. Sobald die optimale Zellkonzentration erhalten worden ist, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml kaltem Puffer. Spin down die Zellen bei 300 × g für 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge (2-8 ° C). Nach der Zentrifugation absaugen Überstand vollständig mit einer Pipette. Nicht Dekantieren des Überstandes, da dies zu Zellverlust und ungenau Volumina führen wird. Wiederholen Sie den Waschvorgang, die der Zugabe von 10 ml kaltem Puffer, Zentrifugation und Aspiration besteht. Jetzt, da wir ein Pellet der gewünschten Reinheit haben, die Zellen in 80 ul der kalten Kulturmedium. Um beschriften, werden wir nun mit 20 ul der Maus IL-17 Catch-Reagenz. Inkubieren Sie die Zellen für 5 Minuten auf dem Eis. Nach der 5 Minuten Inkubationszeit auf Eis, entfernen Sie den Schlauch und verdünnen die Zellen in 10 ml 37 ° C warmen Medium. Dann sichern Sie den Schlauch auf den MACSmix Tube Rotator und inkubieren das Rohr bei 37 ° C für 45 min unter ständiger Bewegung. Eine Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C wird neu gestartet Zytokinsekretion. Labeling der Zellen mit IL-17 Detection Antibody (Biotin) und Anti-Biotin-PE Nach dem 45 Minuten-Sekretion Zeitraum bei 37 ° C wird das Reagenzglas sofort auf Eis. Dieser stoppt Zytokinsekretion. Von hier aus ist es wichtig, die Zellen auf Eis zu halten.Arbeiten mit kaltem Puffer wird verhindert Kreuzkontaminationen des Catch Reagent. Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem Puffer und Zentrifuge bei 300xg bei 2-8 ° C für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. Das Zellpellet wird in 80 ul kaltem Puffer resuspendiert und die Röhre wird auf Eis gelegt. Um zu vermeiden, unspezifische Bindung des Antikörpers, empfehlen wir die Zugabe von 10 &mgr; l FcR Blockierungsreagenz und auf Eis inkubieren für 5 min. Dann fügen wir 20 uL Maus IL-17 Detection Antibody (Biotin), die konjugierte Biotin und für 10 Minuten auf Eis inkubieren ist. Wieder einmal waschen Sie die Zellen wie wir schon früher durch Zugabe von 10 ml kaltem Puffer und Zentrifuge bei 300xg bei 2-8 ° C für 10 min durchgeführt. Jetzt saugen Sie den Überstand und Zellpellet in 80 ul kaltem Puffer. Add 20 uL unserer sekundären Antikörper, Anti-Biotin-PE. Mischen Sie die Zellen und sekundären Antikörper-Lösung, und wieder inkubieren Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis. Nach dieser zweiten Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen mit 10 ml kaltem Puffer und Zentrifuge. Das Pellet kann nun in 500 ul kaltem Puffer resuspendiert werden. Wenn die Zellen für weitere Downstream-Analyse getrennt werden müssen, können sie magnetisch mit Anti-PE-MicroBeads beschriftet werden und manuell oder automatisiert mittels MACS-Säulen und MACS-Separatoren getrennt. Wir haben nun die Beschriftung der Splenozyten abgeschlossen und sind für die Analyse bereit. FACS-Analyse Für unsere Analyse werden wir die stimulierten und unstimulierten Splenozyten mittels Durchflusszytometrie zu vergleichen. Vor durchflusszytometrischen Analyse werden die Zellen mit Propidiumiodid bei 0,5 pg / mL zu Tor aus toten Zellen gefärbt. Die MACSQuant ™ Analyzer wurde mit 200.000 Zellen pro Probe geladen und wir werden in Zukunft an die Streudiagramme der relativen Antikörperreaktivität in den Proben zu suchen. Zwei wichtige Aspekte für die Analyse von seltenen Zellen – wie IL-17-positiven Zellen – mittels Durchflusszytometrie sind: Einstellung ein Tor auf Lymphozyten in der Vorwärtsstreuung gegenüber Seite Streudiagramm und Ausblendung toten Zellen (gefärbt mit Propidiumiodid) und B-Zellen (die unspezifische Hintergrundfärbung führen) zur weiteren Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit Wir verwendeten CD4-APC-Antikörper gegen T-Zellen und die CD45R/B220-PerCP Antikörper gegen den B-Zellen erkennen zu erkennen. Wir sehen die Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht Eigenschaften der Proben und wenden ein Tor auf der Lymphozyten-Population. Ein zweites Tor wurde angewandt, um die bunten abgestorbenen Zellen und gefärbte B-Zellen (Y-Achse) zu sehen. Diese Zellen sind von der T-Zell-Analyse ausgeschlossen. In diesem Beispiel, der im Wesentlichen unsere Negativ-Kontrolle, können wir sehen, dass es nur sehr wenige IL-17 sezernierenden CD4-positiven T-Zellen in unstimulierten Proben – etwa 0,003% (Abbildung 4). Mit Blick auf die stimulierten T-Zell-Population, können wir sehen, eine beträchtliche Anzahl von CD4-positiven T-Zellen, die Sekretion von IL-17 – über 0,367% (Abbildung 5A) vor der Trennung und 60,76% nach magnetischer Separation mit MACS Technology (Abbildung 5B).