Detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen

De voorbereiding van de reagentia Maak een buffer met PBS met BSA (0,5%), en 2 mM EDTA. Omdat de luchtbellen kan blokkeren MACS scheiding kolommen, de buffer moet worden ontgast en bewaard bij 2-8 ° C voor gebruik. We maken gebruik van RPMI 1640 medium dat 5% muis serum. Het kweekmedium mag geen BSA of FCS, aangezien voor deze verbindingen zal de specificiteit van de cel stimulatie te veranderen. De muis IL-17 secretie test – Cel Verrijking en Detection Kit van Miltenyi-Biotec. De kit bevat de volgende onderdelen: de IL-17 Catch Reagens, de IL-17 detectieantilichaam (Biotine), de Anti-biotine-PE en de Anti-PE microbolletjes. Het stimuleren van de Splenocyten Dit protocol is uitgevoerd in de aanwezigheid van een negatieve en positieve controle, zoals ongestimuleerde splenocyten en een tegenkleuring voor de T-cellen. Dit protocol is uitgevoerd met behulp van steriele techniek. Bereid een celsuspensie van de muis splenocyten die werden geïsoleerd met behulp van de gentleMACS ™ Dissociator. De concentratie van de cellen moet worden vooraf via de cel tellen. Pellet de cellen bij 200 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, aspireer het supernatans uit de korrel met een pipet. Niet decanteren de buis om verlies van de pellet te voorkomen. Nu, resuspendeer de cellen in het kweekmedium en vervolgens aan een goed. Voeg voldoende medium voor een concentratie van tien miljoen cellen per ml en vijf miljoen cellen per vierkante cm. Het stimuleren van een immuunreactie in onze cellen geresuspendeerd, voegen we ionomycine (1 ug / ml) en PMA (10 ng / ml) aan het monster en meng de oplossing door voorzichtig en neer te pipetteren. Dan de putten worden dienovereenkomstig geëtiketteerd. Nu zullen we onze cellen incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C zonder te mengen op de stimulatie periode te beginnen. Ga verder met IL-17 analyse 3 uur vanaf het begin van de stimulatie, zo dienovereenkomstig plannen. Om te stoppen secretie, worden de cellen op ijs en we verzamelen de gestimuleerde cellen door voorzichtig en neer te pipetteren met koude buffer. Cellen worden dan overgebracht van de put naar een buis en worden gewassen een tweede keer. Om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld, is het een goed idee om uw schotel te kijken onder een microscoop. Als cellen nog steeds aangesloten, kunt u het verzamelen van de resterende cellen door het spoelen van de schotel met koude buffer. Elke cel klonten in je cel suspensie kan worden verwijderd met de pre-scheiding filters. Het labelen van de Cellen met Catch reagens Het is van groot belang op te merken, dat deze test optimaal werkt als minder dan 2% van de IL-17-afscheidende cellen aanwezig zijn. Als de concentratie van IL-17 afscheidende cellen wordt verwacht dat meer dan 2% worden dienovereenkomstig aan te passen volumes. Een mogelijke valkuil van deze procedure is kruisbesmetting van de Catch reagens, die kunnen optreden tijdens de etikettering als de bi-specifieke antilichaam bindt aan een niet-afscheidende T-cel en vallen IL-17 afgescheiden uit een naburig lymfocyt, waardoor het genereren van valse positieven. Om dit probleem te omzeilen, is het essentieel om af te koelen cellen af ​​voorafgaand aan de etikettering van en werken met koude buffer om verspreiding van IL-17 langzaam en dit kruisbesmetting te voorkomen. In aanvulling op het houden van de cellen te koud is, moeten ze worden bewaard bij een bepaalde concentratie. Om te beginnen de etikettering procedure maken we gebruik van tien miljoen cellen in een 15 ml afsluitbare buis. Als hogere cel aantallen moeten worden gebruikt, simpelweg schaal-up van alle volumes dienovereenkomstig. Zodra de optimale celconcentratie is verkregen, was de cellen door het toevoegen van 10 ml koud buffer. Spin down de cellen op 300 xg gedurende 10 minuten in een gekoelde centrifuge (2-8 ° C). Na centrifugatie, aspireer het supernatant volledig met behulp van een pipet. Niet decanteer het supernatant omdat dit zal leiden tot cel-verlies en onnauwkeurig volumes. Herhaal het wassen stap die bestaat uit het toevoegen van 10 ml koude buffer, centrifugeren, en aspiratie. Nu we een pellet van de gewenste zuiverheid hebben, resuspendeer de cellen in 80 microliter van koud kweekmedium. Om label hen, zullen we nu toevoegen 20 ul van Mouse IL-17 Catch reagens. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten op ijs. Na de 5 minuten incubatietijd op ijs, verwijdert u de tube en verdun de cellen in 10 ml van 37 ° C warm medium. Bevestig vervolgens de buis op de MACSmix Tube Rotator en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 45 min onder voortdurend in beweging. Het verhogen van de temperatuur tot 37 ° C wordt opnieuw gestart cytokine secretie. Het labelen van de cellen met IL-17 detectieantilichaam (biotine) en Anti-biotine-PE Na de 45 minuten periode van afscheiding bij 37 ° C, onmiddellijk plaats de buis op het ijs. Dit zal stoppen met cytokine secretie. Vanaf hier is het essentieel om cellen te houden op het ijs.Werken met koude buffer voorkomt kruisbesmetting van de Catch reagens. Vul de buis met koude buffer en centrifugeer bij 300xg bij 2-8 ° C gedurende 10 minuten. Volledig aspireren het supernatant. Herhaal de wasstap nog een keer. De cel pellet wordt geresuspendeerd in 80 ul van koude buffer en de buis is geplaatst op ijs. Om te voorkomen dat niet-specifieke binding van het antilichaam, raden wij de toevoeging van 10μl FcR Blocking Reagent en incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Dan voegen we 20 ul van Mouse IL-17 detectieantilichaam (Biotine), dat is geconjugeerd aan biotine en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Nogmaals, wassen cellen als we eerder hebben gedaan door het toevoegen van 10 ml koude buffer en centrifugeer bij 300xg bij 2-8 ° C gedurende 10 minuten. Nu het supernatans aspireren en resuspendeer de cel pellet in 80 ul van koude buffer. Voeg 20 ul van onze secundaire antilichaam, anti-biotine-PE. Meng de cellen en secundaire antilichaam-oplossing, en weer de buis incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Zodra deze tweede incubatie is voltooid, was de cellen met 10 ml koude buffer en centrifuge. De pellet kan nu worden gesuspendeerd in 500 pi van koude buffer. Als de cellen moeten worden gescheiden voor verder stroomafwaarts analyse, kunnen ze magnetisch gelabeld worden met anti-PE-microbolletjes en het handmatig of automatisch gescheiden met behulp van MACS Kolommen en MACS Separators. We hebben nu de etikettering van de splenocyten en zijn klaar voor analyse. FACS-analyse Voor onze analyse, zullen we vergelijken gestimuleerd en ongestimuleerde splenocyten door flowcytometrie. Voordat flowcytometrische analyse, worden de cellen gekleurd met propidiumjodide op 0,5 ug / ml tot gate uit dode cellen. De MACSQuant ™ Analyzer was geladen met 200.000 cellen voor elk monster en we nu gaan kijken naar de spreiding percelen van relatieve antilichaamreactiviteit in de monsters. Twee belangrijke overwegingen voor de analyse van zeldzame cellen – zoals IL-17 positieve cellen – door flowcytometrie zijn: het instellen van een poort op lymfocyten in de voorwaartse verstrooiing versus kant scatterplot en gating uit dode cellen (gekleurd met propidiumjodide) en B-cellen (die niet-specifieke achtergrondkleuring kan veroorzaken) aan verdere versterking van de gevoeligheid van de detectie We gebruikten CD4-APC antilichaam aan T-cellen en de CD45R/B220-PerCP antilichaam tegen de B-cellen te detecteren detecteren. We zien de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing eigenschappen van de monsters en breng een hek aan de lymfocyten bevolking. Een tweede poort was toegepast op de gekleurde dode cellen en gekleurd B-cellen (Y-as) te zien. Deze cellen zijn uitgesloten van de T-cel-analyse. In dit voorbeeld, dat in wezen onze negatieve controle, kunnen we zien dat er zeer weinig IL-17 afscheiden CD4-positieve T-cellen in ongestimuleerde monsters – ongeveer 0,003% (figuur 4). Kijkend naar de gestimuleerde T-cel populatie, zien we een groot aantal CD4-positieve T-cellen die IL-17 afscheiden – ongeveer 0,367% (figuur 5A) voor de scheiding en 60,76% na magnetische scheiding met MACS Technology (figuur 5B).