Détection et isolement des cellules de souris viables T IL-17-sécrétrices

Préparation des réactifs Faire un tampon contenant du PBS avec BSA (0,5%), et 2 mM d'EDTA. Parce que les bulles d'air peuvent bloquer les colonnes de séparation MACS, le tampon doit être dégazée et stocké à 2-8 ° C avant utilisation. Nous utilisons un milieu RPMI 1640 contenant du sérum de souris de 5%. Le milieu de culture ne doit pas contenir de BSA ou FCS, car ces composés va modifier la spécificité de la stimulation cellulaire. L'IL-17 Souris Assay sécrétion – enrichissement cellulaire et le kit de détection de Miltenyi-Biotec. Le kit contient les éléments suivants: l'IL-17 Réactif Catch, l'IL-17 anticorps de détection (biotine), l'anti-biotine-PE, et les microbilles anti-PE. Stimuler les splénocytes Ce protocole est effectuée en présence d'un contrôle positif et négatif, comme splénocytes non stimulées et une contre-coloration des cellules T. Ce protocole est réalisé en utilisant une technique stérile. Préparer une suspension cellulaire unique de splénocytes de souris qui ont été isolés en utilisant les dissociateur gentleMACS ™. La concentration des cellules devraient être prédéterminés par le comptage des cellules. Pellet les cellules à 200 g pendant 10 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirer le surnageant hors du culot à l'aide d'une pipette. Ne pas transvaser le tube pour éviter la perte de la pastille. Maintenant, remettre en suspension les cellules dans le milieu de culture et ensuite ajouter à un puits. Ajouter moyennes suffisante pour une concentration de dix millions de cellules par ml et cinq millions de cellules par cm carré. Afin de stimuler une réponse immunitaire dans nos cellules en suspension, nous ajoutons ionomycine (1 pg / ml) et PMA (10 ng / mL) à l'échantillon et mélanger la solution par un léger pipetage de haut en bas. Puis les puits sont étiquetés en conséquence. Maintenant, nous allons incubation de nos cellules pour 3 heures à 37 ° C sans mélange de commencer la période de stimulation. Passez à l'IL-17 à 3 heures de l'analyse du début de la stimulation, afin de planifier en conséquence. Pour arrêter la sécrétion, les cellules sont placées sur la glace et nous recueillons les cellules stimulées par un léger pipetage de haut en bas avec le tampon froid. Les cellules sont ensuite transférées à partir du puits d'un tube et sont lavés une seconde fois. Afin de s'assurer que toutes les cellules sont recueillies, c'est une bonne idée de vérifier votre plat sous un microscope. Si les cellules restent encore attachés, vous pouvez collecter les cellules restantes en rinçant la vaisselle avec du tampon froid. Tout amas de cellules dans votre suspension cellulaire peut être enlevé en utilisant les filtres de pré-séparation. Marquage des cellules avec le réactif Catch Il est primordial de noter que ce test fonctionne de manière optimale si moins de 2% de l'IL-17-cellules sécrétrices sont présents. Si la concentration de cellules sécrétant de l'IL-17 devrait être supérieure à 2% des volumes d'ajuster en conséquence. Un écueil potentiel de cette procédure est la contamination croisée des réactifs Catch, qui peuvent survenir lors de l'étiquetage lorsque l'anticorps bi-spécifique se lie à une cellule T non sécrétant et des pièges de l'IL-17 sécrétée par un lymphocyte voisins, générant ainsi des faux positifs. Afin de contourner ce problème, il est essentiel de cellules refroidir avant de l'étiquetage et à travailler avec tampon froid pour ralentir la diffusion de l'IL-17 et d'éviter cette contamination croisée. En plus de maintenir les cellules froides, ils doivent être maintenus à une concentration définie. Pour commencer la procédure de labellisation, nous utilisons dix millions de cellules dans un tube de 15 ml refermable. Si le nombre de cellules supérieur doivent être utilisés, il suffit de l'échelle de tous les volumes en conséquence. Une fois la concentration cellulaire optimale a été obtenue, laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon froid. Isoler les cellules à 300 g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée (2-8 ° C). Après la centrifugation, aspirer le surnageant complètement en utilisant une pipette. Ne pas transvaser le surnageant que cela mènera à la perte de cellules et les volumes imprécis. Répéter l'étape de lavage qui consiste à ajouter 10 ml de tampon froid, centrifugation, et l'aspiration. Maintenant que nous avons une pastille de pureté désirée, remettre en suspension les cellules dans 80 uL de milieu de culture froide. Pour eux, l'étiquette, nous allons maintenant ajouter 20 ul de souris IL-17 Réactif Catch. Incuber les cellules pendant 5 minutes sur la glace. Après la période d'incubation de 5 minutes sur la glace, enlever le tube et diluer les cellules dans 10 ml de 37 ° C mi-chaud. Fixez ensuite le tube sur le Tube Rotator MACSmix et incuber le tube à 37 ° C pendant 45 min sous un mouvement continu. Augmenter la température à 37 ° C redémarre sécrétion de cytokines. Marquage des cellules avec l'anticorps de détection IL-17 (biotine) et anti-biotine-PE Après la période de sécrétion de 45 minutes à 37 ° C, placer le tube immédiatement sur la glace. Cela va arrêter la sécrétion de cytokines. A partir de là il est essentiel de garder les cellules sur la glace.Travailler avec le tampon froid va éviter la contamination croisée du réactif de capture. Remplir le tube avec tampon froid et centrifuger à 300xg à 2-8 ° C pendant 10 min. Aspirer le surnageant complètement. Répéter l'étape de lavage une fois de plus. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 ul de tampon froid et le tube est mis sur la glace. Afin d'éviter une liaison non spécifique de l'anticorps, nous recommandons l'ajout de réactif FcR 10 ul de blocage et incuber sur glace pendant 5 min. Puis nous ajoutons 20 ul de souris IL-17 anticorps de détection (biotine) qui est conjugué à la biotine et incuber pendant 10 minutes sur la glace. Encore une fois, se laver les cellules que nous avons fait avant en ajoutant 10 ml de tampon froid et centrifuger à 300xg à 2-8 ° C pendant 10 min. Maintenant aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 80 ul de tampon froid. Ajouter 20 uL de nos anticorps secondaire, anti-biotine-PE. Mélanger les cellules et une solution d'anticorps secondaire, et à nouveau incuber le tube pendant 10 minutes sur la glace. Une fois cette seconde incubation est terminée, laver les cellules avec 10 ml de tampon froid et centrifuger. Le culot peut désormais être remis en suspension dans 500 ul de tampon froid. Si les cellules doivent être séparées pour l'analyse plus loin en aval, elles peuvent être marquées magnétiquement avec l'Anti-PE-microbilles et séparés manuellement ou automatisées à l'aide de colonnes MACS et séparateurs MACS. Nous avons maintenant terminé l'étiquetage des splénocytes et sont prêtes pour l'analyse. Analyse par FACS Pour notre analyse, nous allons comparer les splénocytes stimulés et non stimulés par cytométrie en flux. Avant l'analyse par cytométrie en flux, les cellules sont colorées avec de l'iodure de propidium à 0,5 pg / mL à la porte des cellules mortes. L'analyseur de MACSQuant ™ a été chargé avec 200 000 cellules pour chaque échantillon et nous sommes maintenant allons regarder les diagrammes de dispersion de la réactivité des anticorps par rapport dans les échantillons. Deux considérations importantes pour l'analyse de cellules rares – comme l'IL-17 cellules positives – par cytométrie en flux sont: la fixation d'un porte sur les lymphocytes dans la diffusion vers l'avant par rapport nuage de côté et gating sur les cellules mortes (colorées à l'iodure de propidium) et des cellules B (qui peut causer des taches de fond non spécifique) pour améliorer encore la sensibilité de détection Nous avons utilisé CD4-APC anticorps pour détecter les cellules T et l'anticorps pour détecter CD45R/B220-PerCP les cellules B. Nous voyons les propriétés de diffusion vers l'avant et latérales des échantillons et d'appliquer une grille sur la population de lymphocytes. Une deuxième porte a été appliquée pour voir les cellules colorées et les cellules mortes B teinté (axe Y). Ces cellules sont exclus de l'analyse des cellules T. Dans cet exemple, qui est essentiellement de notre contrôle négatif, nous pouvons voir qu'il ya très peu d'IL-17 CD4 sécrétant positifs dans les échantillons de cellules T non stimulées – environ 0,003% (figure 4). En regardant la population des cellules T stimulées, on peut voir un nombre important de cellules CD4 positives des cellules T qui sécrètent l'IL-17 – environ 0,367% (figure 5A) avant la séparation et 60,76% après la séparation magnétique avec la technologie MACS (figure 5B).