Detección y aislamiento de células viables Ratón T IL-17 Secretoras

Preparación de los reactivos Hacer un tampón que contiene PBS con BSA (0,5%), y 2 mM EDTA. Debido a que las burbujas de aire pueden bloquear columnas MACS separación, el buffer debe ser desgasificado y almacenado a 2-8 ° C antes de su uso. Usamos medio RPMI 1640 que contenía 5% de suero de ratón. El medio de cultivo no debe contener BSA o FCS, ya que estos compuestos alteran la especificidad de la estimulación de las células. La IL-17 de ratón Ensayo secreción – Enriquecimiento de células y kit de detección de Miltenyi Biotec-. El kit contiene los siguientes componentes: la IL-17 Reactivo de captura, la IL-17 de detección de anticuerpos (Biotina), el anti-biotina-PE, y el MicroBeads Anti-PE. Estimular los esplenocitos Este protocolo se realiza en presencia de un control positivo y negativo, como esplenocitos estimulados y de contraste de las células T. Este protocolo se lleva a cabo mediante una técnica estéril. Prepare una suspensión de células individuales de esplenocitos de ratón que fueron aislados usando el disociador gentleMACS ™. La concentración de células debe ser determinado a través de recuento de células. Que sedimenten las células a 200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se aspira el sobrenadante de la bolita con una pipeta. No se decanta el tubo para evitar la pérdida de la pastilla. Ahora, volver a suspender las células en el medio de cultivo y luego agregar a un pozo. Añadir medio suficiente para una concentración de diez millones de células por ml y cinco millones de células por centímetro cuadrado. Para estimular una respuesta inmunológica en las células resuspendidas, añadimos ionomicina (1 mg / ml) y PMA (10 ng / mL) a la muestra y mezclar la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, los pozos están etiquetados en consecuencia. Ahora, vamos a incubar las células durante 3 horas a 37 ° C sin que se mezclen para iniciar el período de estimulación. Proceder a la IL-17 análisis de 3 horas desde el inicio de la estimulación, por lo que planificar en consecuencia. Para detener la secreción de las células se colocan sobre hielo y recoger las células estimuladas con cuidado pipeteando arriba y abajo con tampón frío. Las células se transfieren desde el pozo a un tubo y se lavan por segunda vez. Para asegurarse de que todas las células se recogen, es una buena idea revisar su plato con un microscopio. Si las células siguen unidos, usted puede recoger las células que quedan por aclarar el plato con un tampón frío. Cualquier grupo de células en suspensión de células se pueden eliminar utilizando los filtros de pre-separación. Etiquetado de las células con el reactivo de captura Es de suma importancia señalar, que esta prueba funciona de manera óptima si menos del 2% de células IL-17-secretoras están presentes. Si la concentración de las células secretoras de IL-17 se espera que sea superior al 2% ajustar el volumen en consecuencia. Un riesgo potencial de este procedimiento es la contaminación cruzada de los reactivos de captura, lo que puede ocurrir durante el etiquetado cuando el anticuerpo bi-específicos se une a una célula T no secretor y las trampas de la IL-17 secretada por un linfocito vecinos, generando así los falsos positivos. Con el fin de evitar este problema, es fundamental que las células se enfríe antes de que el etiquetado y el trabajo con tampón frío para disminuir la difusión de la IL-17 y evitar esta contaminación cruzada. Además de mantener las células en frío, que deben mantenerse a una concentración definida. Para comenzar el procedimiento de etiquetado, utilizamos diez millones de células en un tubo de 15 ml con cierre. Si es mayor el número de células tienen que ser utilizados, simplemente escala de todos los volúmenes en consecuencia. Una vez que la concentración óptima de la célula se ha obtenido, se lavan las células mediante la adición de 10 ml de solución tampón frío. Centrifugar las células a 300 g durante 10 minutos en una centrífuga refrigerada (2-8 ° C). Tras la centrifugación, aspirar el sobrenadante por completo con una pipeta. No se decanta el sobrenadante, ya que dará lugar a la pérdida de células y de los volúmenes imprecisos. Repita el paso de lavado, que consiste en agregar 10 ml de tampón frío, centrifugación y aspiración. Ahora que tenemos una bolita de la pureza deseada, resuspender las células en 80 L de medio de cultivo frío. Para etiquetar ellos, ahora vamos a añadir 20 l de reactivo de captura del ratón IL-17. Se incuban las células durante 5 minutos en hielo. Después del período de incubación de 5 minutos en hielo, retire el tubo y diluir las células en 10 ml de 37 º C a medio caliente. A continuación, fijar el tubo en el rotador del tubo MACSmix e incubar el tubo a 37 ° C durante 45 minutos en movimiento continuo. El aumento de la temperatura a 37 ° C se reiniciará la secreción de citoquinas. Etiquetado de las células con anticuerpos de detección de IL-17 (biotina) y anti-biotina-PE Después del período de la secreción de 45 minutos a 37 ° C, se coloca el tubo en hielo inmediatamente. Esto evitará que la secreción de citoquinas. A partir de aquí es muy importante para mantener las células en hielo.Trabajar con un tampón frío se evitará la contaminación cruzada de los reactivos de captura. Llenar el tubo con tampón frío y centrifugar a 300xg a 2-8 º C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante por completo. Repita el paso de lavado una vez más. El pellet de células se resuspende en 80 l de tampón frío y el tubo se coloca en el hielo. Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo, se recomienda la adición de reactivos FcR 10μl de bloqueo e incubar en hielo durante 5 min. Luego se añaden 20 L de ratón de detección de anticuerpos IL-17 (biotina), que se conjuga con biotina y se incuba durante 10 minutos en hielo. Una vez más, lavar las células como lo hemos hecho antes mediante la adición de 10 ml de tampón frío y centrifugar a 300xg a 2-8 º C durante 10 min. Ahora aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 80 l de tampón frío. Añadir 20 l de nuestra secundaria de anticuerpos, anti-biotina-PE. Mezclar las células y la solución de anticuerpo secundario, y de nuevo se incuba el tubo durante 10 minutos en hielo. Una vez que esta segunda incubación se completa, se lavan las células con 10 ml de tampón frío y centrifugar. El pellet de ahora puede ser resuspendido en 500 L de tampón frío. Si las células tienen que ser separados para el análisis de aguas abajo, pueden ser marcadas magnéticamente con Anti-PE-MicroBeads y separados de forma manual o automática utilizando columnas MACS y separadores de MACS. Hemos completado el etiquetado de los esplenocitos y están listos para su análisis. FACS análisis Para nuestro análisis, vamos a comparar los esplenocitos estimulados y no estimulados por citometría de flujo. Antes del análisis de citometría de flujo, las células se tiñeron con yoduro de propidio a 0,5 mg / ml a la puerta de las células muertas. El MACSQuant Analyzer ™ se ha cargado con 200.000 células por cada muestra y que ahora se va a mirar los gráficos de dispersión de la reactividad de los anticuerpos en relación a las muestras. Dos consideraciones importantes para el análisis de células raras – como la IL-17 células positivas – por citometría de flujo son los siguientes: establecimiento de una puerta en los linfocitos de la dispersión frontal versus gráfico de dispersión lateral gating y las células muertas (teñidas con yoduro de propidio) y las células B (que puede causar la tinción de fondo inespecífica) para mejorar aún más la sensibilidad de detección Hemos utilizado CD4-APC anticuerpos para detectar las células T y los anticuerpos CD45R/B220-PerCP para detectar las células B. Vemos las propiedades de dispersión frontal y lateral de las muestras y aplicar una puerta en la población de linfocitos. Una segunda puerta se aplicó para ver las células teñidas muertos y células teñidas B (eje Y). Estas células son excluidos del análisis de células T. En este ejemplo, que es esencialmente nuestro control negativo, podemos ver que hay células IL-17 CD4 secretan muy pocos positivos en las muestras de T estimuladas – aproximadamente 0,003% (Figura 4). En cuanto a la población de células T estimuladas, podemos ver un gran número de células CD4 positivas las células T que secretan IL-17 – de 0.367% (Figura 5) antes de la separación y el 60,76% después de la separación magnética con tecnología MACS (Figura 5).