Summary
O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.
Abstract
Avanços recentes na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm permitido a geração de diferentes tipos celulares, incluindo adipócitos. Entretanto, os métodos de diferenciação atuais têm baixa eficiência e não produzem uma população homogênea de adipócitos. Aqui, contornamos esse problema usando um método baseado em trans-retinóicos para produzir células-tronco mesenquimais (CTMs) em alto rendimento. Ao regular as vias que governam a proliferação, sobrevivência e adesão celular, nossa estratégia de diferenciação permite a geração eficiente de corpos embrionários (EBs) que se diferenciam em uma população pura de CTMs multipotentes. O elevado número de CTMs geradas por este método fornece uma fonte ideal para a geração de adipócitos. No entanto, a heterogeneidade da amostra resultante da diferenciação dos adipócitos permanece um desafio. Portanto, usamos um método à base de vermelho do Nilo para purificar adipócitos maduros portadores de lipídios usando FACS. Essa estratégia de classificação nos permitiu estabelecer uma maneira confiável de modelar distúrbios metabólicos associados aos adipócitos usando um pool de adipócitos com heterogeneidade amostral reduzida e funcionalidade celular aprimorada.
Introduction
As células-tronco mesenquimais (CTMs) atuam como um recurso transitório efetivo para a produção de células de origem mesodérmica, como adipócitos, osteócitos e condrócitos, que poderiam ser posteriormente utilizadas para modelar suas respectivas doenças genéticas. No entanto, abordagens anteriores baseavam-se na obtenção dessas CTMs a partir de tecidos adultos 1, o que impunha o desafio de obtê-las em grande número dos doadores e a limitação de mantê-las funcionalmente viáveis em condições subótimas de cultivo in vitro 1,2. Esses obstáculos têm gerado uma grande demanda de se ter um protocolo para geração de CTMs in vitro. Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) podem ser usadas como uma fonte valiosa de CTMs, exibindo características deCTMs 3,4,5. As CTMs derivadas de iPSCs podem ser utilizadas como opção terapêutica em diversas doenças. Além disso, a capacidade das CTMs derivadas de iPSCs de gerar adipócitos as torna um valioso modelo humano in vitro para estudar adipogênese humana, obesidade e distúrbios associados a adipócitos.
Os protocolos atuais de diferenciação de adipócitos podem ser classificados em dois grupos, com um envolvendo diferenciação de adipócitos usando coquetéis químicos ou à base de proteínas, resultando em um rendimento de 30%-60%6,7,8,9, enquanto o outro envolvendo manipulação genética para indução robusta de fatores-chave de transcrição que governam o desenvolvimento de adipócitos para dar um rendimento de 80%-90%10, 11º. No entanto, a manipulação genética não recapitula o processo natural de diferenciação dos adipócitos e, muitas vezes, mascara os paradigmas sutis que chegam durante a adipogênese, tornando-a ineficaz para fins de modelagem da doença12,13. Portanto, apresentamos uma maneira de classificar adipócitos maduros quimicamente derivados de imaturos marcando fluorescentemente adipócitos portadores de lipídios usando vermelho do Nilo.
Apresentamos aqui um protocolo envolvendo a incubação transitória de corpos embrionários (EBs) derivados de iPSCs com ácido all-trans retinóico para produzir um grande número de CTMs de rápida proliferação, que poderiam ser posteriormente utilizadas para gerar adipócitos14. Também apresentamos uma maneira de classificar adipócitos maduros derivados quimicamente do pool de diferenciação heterogênea marcando fluorescentemente suas gotículas lipídicas usando um corante lipofílico; Vermelho do Nilo. Isso permitiria a geração de uma população pura de adipócitos maduros com funcionalidade aprimorada para modelar com precisão os distúrbios metabólicos associados aos adipócitos.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa institucional apropriado e realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HMC (nº 16260/16) e QBRI (nº 2016-003). Este trabalho também é otimizado para hESCs como H1 e H9. Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos sadios com pleno consentimento informado. As iPSCs são geradas a partir de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos saudáveis.
1. Cultura e manutenção de iPSCs
- Preparar placas revestidas com matriz de membrana basal reconstituindo a matriz de revestimento em knockout-DMEM na proporção de 1:80 e armazenar a 4 °C.
- Preparar meios de cultura iPSCs adicionando 50 mL de 10x meio de suplemento de células-tronco a 500 mL de meio basal de células-tronco, juntamente com 5 mL de 100x penicilina-estreptomicina (P/S) e armazenar a 4 °C para uso a curto prazo ou a -20 °C para uso a longo prazo.
- Forre as placas com matriz de revestimento - 1 mL para uma placa de 6 poços, 500 μL para uma placa de 12 poços, 250 μL para uma placa de 24 poços - e incube a placa a 37 °C por 1-2 h.
- Remova uma alíquota de meios de cultura iPSCs e pré-aqueça à temperatura ambiente antes de usar.
- Descongelar um frasco para injetáveis de iPSCs (CTEs ou iPSCs) em banho-maria a 37 °C e transferir para um tubo cônico de 15 mL contendo 2-3 mL de meio de cultura.
- Centrifugar o tubo a 120 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente (RT-23 °C).
- Retirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de cultura fresco suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK (Y-27632). Plaquear as células em um poço de uma placa de 6 poços revestida com matriz e colocar a placa a 37 °C.
- Após 24 h, retirar o meio e substituí-lo por meios de cultura frescos.
- Troque o meio todos os dias até que as células atinjam 80%-90% de confluência.
- Ao atingir a confluência, passe as células seguindo os passos descritos abaixo.
- Retire o meio e lave as células com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco.
- Adicionar reagente de dissociação iPSCs (ver Tabela de Materiais)-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços, 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços - e incubar por 1 min a 37 °C.
- Remover o reagente de dissociação e incubar as células secas por 1 min a 37 °C.
- Coletar as células usando meio de cultura - 1 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços - em um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 120 x g por 4 min.
- Ressuspender as células em meio de cultura - 2 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 500 μL para um poço de uma placa de 24 poços suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM e plaqueá-las em placas revestidas com matriz fresca a 40% de confluência.
2. Diferenciação de iPSC em CTMs
- Preparar meios de diferenciação de CTM adicionando 15% de soro fetal bovino (SFB) e 1% P/S a DMEM + piruvato de baixa glicose e armazenar a 4 °C.
- Ao atingir 80% de confluência, utilizar iPSCs para formação do corpo embrionário (BE) seguindo os passos descritos abaixo.
- Lavar as células com DPBS e incubá-las com meio de dissociação/EDTA-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços, 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços.
- Incubar a 37 °C durante 1 min, aspirar o reagente de dissociação e manter as células a 37 °C durante mais 1 min. Para iniciar a diferenciação MSC, ~10-12 x 106 células são necessárias.
- Coletar as células em um tubo cônico de 15 mL usando meios de cultura. Certifique-se de ser muito suave durante a coleta para evitar que as células fiquem únicas e permitir a formação de EB. Centrifugar as células a 120 x g durante 4 min.
- Ressuspender as células em 3 mL de meio de diferenciação de CTM contendo 10 μM de inibidor de ROCK.
- Misture e distribua 0,5 mL/poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.
NOTA: O uso de placa de fixação ultrabaixa incentivaria a agregação celular em EBs em vez de sua fixação na superfície. - Colocar a placa na incubadora a 37 °C.
- Após 24 h, induzir as EBs obtidas com tratamento com ácido retinóico (AR) seguindo os passos descritos abaixo.
- Adicionar 10 μM de RA a 3 mL de meio de diferenciação de CTM. Coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.
- Remover o sobrenadante das EBs e adicionar meio de diferenciação MSC suplementado com 10 μM RA.
- Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.
- Colocar a placa na incubadora a 37 °C. Não perturbe os EBs pelas próximas 48 h.
- Após 48 h, coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.
- Remover o sobrenadante das EBs e adicionar meios de diferenciação MSC suplementados com 0,1 μM de AR.
- Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.
- Colocar a placa na incubadora a 37 °C. Não perturbe os EBs pelas próximas 48 h.
- Remova o RA adicionado às células seguindo as etapas descritas abaixo.
- Após 48 h do último tratamento da AR, coletar os EBs e deixá-los descansar por 15 min.
- Remover o sobrenadante e adicionar DMEM meio de baixa glicose sem citocinas.
- Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Colocar a placa na incubadora a 37 °C.
- Plaquete os EBs derivados de iPSCs seguindo as etapas descritas abaixo.
- Após 48 h da etapa anterior (etapa 2.4), coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de meio de diferenciação de CTM fresco.
- Transfira para dois poços de uma placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal.
- Troque a mídia a cada dois dias por mais 5 dias.
- Após 5 dias, remover o meio gasto e substituí-lo por meio de diferenciação de CTM fresco contendo 2,5 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF).
- Passe pelos EBs plaqueados quando atingirem 80%-90% de confluência, seguindo os passos descritos abaixo.
- Lave as células com DPBS, adicione tripsina-EDTA-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços e incube as células a 37 °C por 3 min.
- Coletar as células usando meios de diferenciação de CTM em um tubo cônico de 15 mL e girar a 750 x g por 4 min.
- Ressuspender em meio de diferenciação de CTM com 2,5 ng/mL de bFGF e plaquear as células em placas revestidas com matriz de membrana basal na proporção de 1:3.
- Repita a passagem quando as células atingirem 70%-80% de confluência. Espera-se que ganhe 3-6 milhões de células por 2-3 passagens.
3. Análise por citometria de fluxo de CTMs derivadas de iPSCs
NOTA: Ao passar por 2-3 passagens, as células devem ser acessadas para a eficiência da diferenciação das CTM. A diferenciação será considerada bem-sucedida se as células expressarem marcadores de diferenciação CTM - CD44, CD73, CD90 e CD105 com mais de 90% de eficiência, e não expressarem níveis elevados de marcadores hematopoéticos - CD14, CD19, CD34 e CD45. A eficiência desses marcadores pode ser acessada seguindo os passos abaixo.
- Passe as células usando as etapas descritas acima (passo 2.6) e obtenha 1 x 105 células em um poço de uma placa de 96 poços com fundo em v.
- Centrifugar a placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C.
- Ressuspender 1 x 105 células em 100 μL de DPBS frio com 1 μL de anticorpo conjugado (Ab) (ver Tabela de Materiais) e incubar a 4 °C por 30-40 min, evitando a exposição à luz.
- Ressuspender mais 1 x 105 células em 100 μL de DPBS frio com o respectivo controle isotípico do Ab conjugado na concentração de 1:100 ) e incubar a 4 °C por 30-40 min evitando a exposição à luz.
- Após a incubação, centrifugar a placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante agitando a placa sobre a pia.
- Ressuspender as células em 100 μL de DPBS frio.
- Centrifugar as células a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 200 μL de DPBS fria e coletar em tubos de microcentrífuga escuros e frios de 1,5 mL e mantê-los no gelo até serem analisados por classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
- Para a análise FACS, distribua as células usando dispersão lateral (SSC-A) versus dispersão direta (FSC-A) para excluir os detritos. Além disso, distribua as células fechadas usando altura espalhada para frente (FSC-H) versus área dispersa para frente (FSC-A) para distinguir singlets de duplos da população de células vivas.
NOTA: As células foram fechadas em relação ao deslocamento do controle isotípico para cada marcador, e um mínimo de 10.000 eventos fechados de cada amostra corada foi usado para análise.
4. Diferenciação das CTMs em adipócitos
- Preparar o meio basal de diferenciação de adipócitos adicionando 10% de reposição sérica knockout (KOSR), 1% de glutamina, 1% P/S, 4,5 ng/μL de glicose ao meio essencial mínimo (MEM)-alfa e armazenar a 4 °C.
- Permitir que as CTMs atinjam acima de 90% de confluência. Continue cultivando-os por mais 48 h para permitir que eles passem por um período de parada de crescimento.
- Preparar o meio de diferenciação completa dos adipócitos adicionando 100 μg/mL de 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM de dexametasona, 0,2 U/mL de insulina, 100 μM de indometacina e 10 μM de rosiglitazona ao meio basal.
- Remova o meio de diferenciação MSC e lave as células usando DPBS.
- Adicionar o meio completo de diferenciação de adipócitos - 2 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 1 mL para um poço de uma placa de 12 poços - e incubar as células a 37 °C. Troque a mídia de diferenciação completa a cada dois dias por 14 dias.
5. Avaliação da eficiência de diferenciação de adipócitos
- No 14º dia de diferenciação, verificar a eficiência da diferenciação pela coloração das células para marcadores de maturação de adipócitos, FABP4 e adiponectina.
- Retire o meio e lave as células com DPBS.
- Fixar as células com paraformaldeído (PFA) a 4% - 200 μL em um poço de placa de 24 poços - e incubar à temperatura ambiente por 15 min.
- Eliminar o PFA e lavar com solução salina tris-tamponada com tween 0,5% (TBST) e colocá-lo em um agitador à temperatura ambiente por 15 min. Repita o processo duas vezes.
- Permeabilizar as células fixas com solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100 a 0,5% (PBST) e colocá-las em um agitador à temperatura ambiente por 15-20 min.
- Descarte o PBST e adicione o tampão de bloqueio (5%-6% de albumina de soro bovino (BSA) em PBST)-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços e 250 μL para um poço de uma placa de 12 poços - e incube à temperatura ambiente no agitador por 40-60 min.
- Diluir os anticorpos primários contra FABP4, adiponectina em 2%-3% BSA, a uma concentração de 1:500 (ver Tabela de Materiais). Adicione estes anticorpos apenas se criados em animais diferentes e coloque a placa no agitador a 4 °C, durante a noite.
- Remova os anticorpos primários e lave as células três vezes com TBST (15 min cada) e coloque-as em um agitador à temperatura ambiente.
- Preparar anticorpos secundários Alexa Fluor em PBST (1:500). Incubar as células nas combinações de anticorpos secundários (de acordo com a espécie em que o anticorpo primário é elevado) por 60 minutos à temperatura ambiente e cobrir a placa com papel alumínio para protegê-la da luz.
- Descarte os anticorpos secundários, lave com TBST três vezes e coloque a placa no agitador.
- Para corar os núcleos, adicionar 1 μg/mL de Hoechst 33342-200 μL para um poço de uma placa de 24 poços diluída em PBS e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
- Descarte a solução de Hoechst e adicione PBS-500 μL para um poço de uma placa de 24 poços às células. Mantenha as placas cobertas de luz até serem visualizadas em microscópio de fluorescência invertido.
6. Classificação de adipócitos usando vermelho do Nilo
- Preparar a solução de trabalho vermelha do Nilo adicionando 1 mg/ml de solução-mãe vermelha do Nilo em DMSO e conservar a -20 °C. Logo antes do uso, descongele o estoque vermelho do Nilo e reconstitua em DPBS para atingir a concentração de 300 nM da solução de trabalho.
- No ou após o 14º dia de diferenciação dos adipócitos, descarte o meio das células e lave com DPBS.
- Adicionar a solução de trabalho vermelha do Nilo -1 mL em um poço de uma placa de 6 poços - e incubar a 37 °C por 15 min.
- Remover a solução vermelha do Nilo e adicionar tripsina-EDTA -500 μL em um poço de uma placa de 6 poços - e incubar a 37 °C por 4 min.
- Coletar as células usando DMEM contendo FBS a 5% em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 750 x g por 4 min.
- Retirar o sobrenadante e ressuspender em DPBS-1 mL para 1 x 106 células. Centrifugar a 750 x g por 4 min.
- Retirar o sobrenadante e ressuspender em DPBS-1 mL para 1 x 106 células. Use um classificador FACS para isolar as células vermelhas positivas do Nilo usando o canal FL1.
- Recultivar as células selecionadas em meios de diferenciação de adipócitos ou coletar as células selecionadas para isolamento de RNA e proteínas.
- Extrair o RNA das células selecionadas e realizar análise quantitativa relativa dos marcadores de diferenciação de adipócitos, incluindo FABP4, PPARG e C/EBPA. As células vermelho-positivas do Nilo mostram um aumento significativo na expressão gênica de pelo menos duas vezes em comparação com as células não classificadas.
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Representative Results
Esquema e morfologia das células durante a diferenciação mesenquimal: A diferenciação de iPSCs em CTMs envolve vários estágios de desenvolvimento abrangendo a formação de EB, diferenciação de CTM e expansão de CTM (Figura 1). Durante esses estágios de desenvolvimento, as células adquirem várias morfologias devido aos diferentes produtos químicos estimulatórios a que são submetidas. Ao iniciar a diferenciação, as células são plaqueadas em suspensão e espera-se que sejam redondas, com bordas celulares definidas, sendo de pequeno a médio diâmetro (Figura 2). A escolha de células cultivadas em suspensão durante a fase inicial de diferenciação permite que se assemelhe ao processo de desenvolvimento embrionário natural, tornando esta fase altamente crucial para o sucesso da diferenciação. A fase de formação da EB e do tratamento da AR é seguida pelo plaqueamento das EBs em placas revestidas com matriz de membrana basal. A viabilidade das EBs ao plaqueamento pode ser acessada observando-se seu comportamento de proliferação rápida, originando mais CTMs (Figura 2). Esse comportamento de proliferação rápida exibido pelas CTMs é mantido mesmo após passá-las para placas revestidas com matriz fresca, além de reter morfologia peculiar e alongada (Figura 2).
Avaliação quantitativa de marcadores de superfície de CTM: A eficiência de diferenciação de CTMs é acessada pela quantificação de marcadores de superfície específicos para diferenciação de CTM. Uma boa diferenciação produzindo CTMs confiáveis deve mostrar eficiência superior a 90% dos marcadores mesenquimais de superfície CD73, CD44 e CD90 (Figura 3A). Além disso, as células também são avaliadas quanto à ausência de marcadores de superfície que representem fenótipo hematopoiético, CD14, CD34 e CD19, esperando-se, portanto, que apresentem menos de 1% de eficiência de expressão para elas (Figura 3B).
Diferenciação de CTMs em adipócitos: A diferenciação de CTMs em adipócitos pode ser acessada pela coloração para FABP4 e adiponectina. A FABP4 é uma proteína citoplasmática e é considerada um marcador de adipócitos terminalmente diferenciados. Sua alta expressão entre os adipócitos, com distribuição citoplasmática, é um sinal chave de sua maturidade de desenvolvimento (Figura 4A). Além da FABP4, a adiponectina é considerada um dos importantes marcadores de maturidade dos adipócitos. Sua alta expressão indica que os adipócitos são funcionais o suficiente para sofrer armazenamento lipídico e adipogênese em resposta à sinalização da glicose. Por ser uma proteína secretora, a adiponectina exibe morfologia globular, com todos os glóbulos proteicos facilmente distinguíveis dentro do citoplasma (Figura 4B).
Coloração e classificação de adipócitos maduros usando vermelho do Nilo: Após a diferenciação, os adipócitos maduros podem ser distinguidos de seus homólogos imaturos pela coloração para vermelho do Nilo. O vermelho do Nilo liga-se aos adipócitos lipídicos, característica exclusiva dos adipócitos maduros (Figura 5A). Isso, juntamente com a característica de rolamento fluorescente do vermelho do Nilo, o torna uma ferramenta eficaz para classificar adipócitos maduros usando citometria de fluxo ativada fluorescente (Figura 5B). A triagem efetiva deve resultar no aumento dos marcadores de maturação - PPARG, C/EBPA e FABP4 - em pelo menos duas vezes, determinado por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) (Figura5C).
Figura 1: Diagrama esquemático mostrando a diferenciação das iPSCs em CTMs e adipócitos. As iPSCs são diferenciadas em CTMs utilizando a técnica do corpo embrióide (BE). As EBs são submetidas a uma curta exposição de 10 μM de ácido all-trans retinóico (AR). As CTMs geradas são diferenciadas em adipócitos 40%-77% com base na linhagem iPSC. As células vermelhas positivas do Nilo são classificadas usando FACS para obter uma população purificada de adipócitos maduros que pode ser usada para estudar distúrbios associados a adipócitos (modelagem de doenças), identificar novas drogas e, eventualmente, para terapia personalizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferenciação das iPSCs em CTMs. Imagens morfológicas representativas mostrando diferentes estágios de diferenciação das CTM nos dias 2 (D2), 11 (D11), 15 (D15) e 24 (D24). Os corpos embrioides (BEs) gerados na presença de 10 μM de AR por 24 h foram plaqueados no 8º dia de diferenciação, seguidos de dissociação e passagem após 12-17 dias de diferenciação. Os MSCs foram aprovados várias vezes. Abreviações: P2 = passagem 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão de marcadores de CTM e marcadores hematopoéticos em CTMs derivadas de iPSC. Histogramas representativos de citometria de fluxo mostrando a expressão dos marcadores CTM, CD73, CD44 e CD90, (A) e hematopoiéticos, CD34, CD19 e CD14 (B) nas CTMs geradas a partir de EBs derivadas de iPSC tratadas com 10 μM de AR. O eixo X no gráfico representa a intensidade fluorescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diferenciação das CTMs derivadas de iPSC em adipócitos. Imagens de imunomarcação mostrando a expressão de FABP4 (A) e adiponectina (ADIPO) (B) em adipócitos maduros derivados de iPSCs. Os núcleos foram corados com Hoechst. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Classificação dos adipócitos derivados da iPSC usando vermelho do Nilo. (A) Imagens mostrando adipócitos maduros corados com campo brilhante (BF) e vermelho do Nilo. (B) Quantificação do vermelho do Nilo (células PE-positivas) em adipócitos maduros utilizando FACS. (C) Análise por PCR em tempo real mostrando a expressão de C/EBPA, FABP4 e PPARG em adipócitos maduros classificados versus não selecionados. Os dados são representados como média ± DP; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo tem importância primordial devido à sua capacidade de fornecer CTMs em alto rendimento e eficiência. Essa produção em massa de CTMs em escala foi possível pela incubação transitória de EBs derivadas de iPSCs com 10 μM de AR14,15. O tratamento transitório com 10 μM de AR aumentou o rendimento das CTM em 11,2 a 1542 vezes14,15, sendo esse protocolo aplicável tanto em iPSCs quanto em hPSCs. Nessa dose e duração do tratamento, a AR melhora a capacidade proliferativa e de sobrevivência das células formadoras de EB pela regulação direta ou indireta da expressão de vários genes envolvidos na proliferação celular, apoptose e aderências célula-célula e MEC, que são críticas para a sobrevivência e proliferação de iPSCs14,16. Os genes incluem, mas não estão limitados a, fatores de transcrição (como EGFR4, SOX4), fatores de crescimento e receptores de fator de crescimento (como IGF2, FGFR4) e moléculas de adesão (como FN1 e CAMs). No entanto, em contraste com baixas doses (0,1-10 μM), em altas doses (≥20 μM), a AR regula negativamente a proliferação e a sobrevivência de células formadoras de EB, resultando em redução do número e tamanho de EB derivadas de LSP e, portanto, diminuição do rendimento deCTMs 14. A AR é considerada um inibidor da proliferação em várias células normais diferenciadas e cancerosas17,18,19. Nas EBs, a sinalização retinoide é dependente do contexto (tempo, concentração, espécie e linhagem celular); afetando diferencialmente a auto-renovação, sobrevivência e diferenciação de células formadoras de EB através da regulação de genes distintos e vias de sinalização20,21. Portanto, o uso de AR em um tempo e concentração ótimos de RA-10 μM no dia 3 de indução de EB, seguido de redução da dose para 0,1 μM no dia 5 por 2 dias, como descrito no presente protocolo, é crucial para induzir a sobrevivência e proliferação de células formadoras de EB.
Além de regular o crescimento e a sobrevida, a AR submete as EBs tratadas a retardo de diferenciação em comparação com as células não tratadas com AR14. De fato, as EBs tratadas com AR mantêm sua forma compacta após o plaqueamento e não conseguem se diferenciar em células semelhantes às CTM, em contraste com as EBs não tratadas com AR. Isso é consistente com estudos anteriores relatando que a exposição de curto prazo ao tratamento da AR inibe a diferenciação celular por meio da supressão da sinalização WNT21. Além disso, essas células na diferenciação tratadas com AR também mostraram expressão aumentada de caderina e proteínas da matriz extracelular14, que são conhecidas por desempenhar um papel importante na manutenção do estado pluripotente das iPSCs16. Para liberar o bloqueio de diferenciação mediado por AR, as EBs devem ser dissociadas, o que resulta na interrupção das aderências celulares e permite a diferenciação das CTM a longo prazo no plaqueamento. Curiosamente, o tratamento com AR manteve um bloqueio de diferenciação sobre as células, mas não manteve as células em um estado pluripotente. De fato, as células formadoras de EB submetidas à exposição de curto prazo a 10 μM de AR mostram expressão significativamente reduzida dos principais marcadores de pluripotência-OCT4, SOX2 e NANOG14.
Demonstrou-se que as CTMs geradas pelo tratamento de curto prazo da AR das EBs mantêm sua morfologia típica semelhante à de fibroblastos, com expressão abundante de marcadores de superfície das CTM e sua multipotência após criopreservação, tornando essas CTMs produzidas em massa armazenáveis para estudos de expansão de longo prazo14. Ao submetê-las a condições de diferenciação adipogênica, condrogênica e osteogênica, essas CTMs poderiam facilmente se diferenciar nos três tipos celulares mesodérmicos, tornando-as uma fonte facilmente alcançável para a modelagem de doenças relacionadas ao tecido14. Assim, o comportamento in vitro estável e versátil das CTMs geradas pelo protocolo de diferenciação mediado por AR lhes confere importância primordial em cenários de pesquisa e aplicação.
Enquanto os potenciais de diferenciação condrogênica e osteogênica das CTMs obtidas de EBs tratadas com AR parecem ser semelhantes aos das CTMs obtidas de EBs não tratadas, as primeiras apresentaram um potencial aumentado para se diferenciar em linhagem adipogênica quando submetidas a condições de diferenciação adipogênica14. Isso foi evidenciado por um aumento de 2 a 3 vezes no acúmulo intracelular de lipídios (coloração Oil Red O) e células positivas para o marcador adipócito FABP4 no pool de diferenciação de células obtidas após a cultura das CTMs derivadas de EBs tratadas com AR com meios de diferenciação adipogênica, em comparação com CTMs derivadas de EBs não tratadas com AR. Isso poderia ser consequência da regulação, pela AR, de várias vias de sinalização que governam o desenvolvimento dos adipócitos, como as vias de interação hipopótamo, WNT e células da MEC, como revelado pelos dados de sequenciamento de RNA de EBs tratadas e não tratadas com AR 14,22,23,24,25. Essa capacidade aumentada das CTMs derivadas da AR de sofrer diferenciação adipogênica é valiosa, pois os protocolos atualmente disponíveis levam a um baixo rendimento de adipócitos ou fazem uso de manipulação genética, tornando os adipócitos gerados inestimáveis para derivar adipócitos recapitulados por processo natural. Os adipócitos são classificados em três tipos: branco, marrom e bege. Os adipócitos brancos são classificados pela presença de uma única gota lipídica e desempenham um papel no armazenamento de energia. Já os adipócitos marrons estão envolvidos no gasto energético por oxidação do substrato devido à altíssima abundância de mitocôndrias caracterizada pela expressão de UCP1. Já os adipócitos marrons que se encontram localizados no tecido adiposo branco são conhecidos como adipócitos beges ou marrons. Essas CTM têm o potencial de dar um rendimento abundante de adipócitos brancos, dada a pré-exposição das EBs à AR. Publicações anteriores declararam indução seletiva de iPSC em células expressando UCP1 baixa, ou seja, adipócitos brancos, em vez de expor células com altos níveis de UCP1 à AR26. Publicações anteriores relataram que a AR produzida a partir de células da crista neural em embriões de camundongos e peixes-zebra desempenha um papel importante na formação de adipócitos brancos27,28.
Embora o protocolo baseado em AR tenha permitido a geração de CTMs que proporcionam aumento do rendimento de adipócitos atingindo 48,5%-77,4% (vs. 22,5%-57,6% sem tratamento da AR), não atingir >90% ainda é problemático ao modelar distúrbios genéticos multivariantes baseados em adipócitos in vitro. De fato, não atingir uma população de adipócitos puros poderia tornar os resultados provenientes de modelos de doenças multivariantes ambivalentes, pois seria difícil distinguir se as diferenças de desenvolvimento observadas são devidas às diferentes composições genéticas ou devido a eficiências de diferenciação inconsistentes. Para contornar essa questão, era importante classificar as células diferenciadas para obter um pool de adipócitos maduros puros, de modo que quaisquer diferenças nos fenótipos só pudessem ser atribuídas a diferenças genéticas inerentes. Vários estudos identificaram marcadores de superfície em adipócitos que poderiam ser potencialmente usados para triagem. Por exemplo, o trabalho realizado por Ronald Kahn permitiu a identificação do transportador de aminoácidos ASC-1 como um novo marcador de superfície em adipócitos brancos29. Além disso, estudos extraindo adipócitos maduros das regiões omental e subcutânea relataram que adipócitos maduros expressam CD34, CD36 e CD59 em suas superfícies30, onde foi relatado que CD36 funciona como um transportador de ácidos graxos na superfície de adipócitos maduros31. Entretanto, esses estudos têm utilizado populações heterogêneas de células derivadas do tecido adiposo sem especificar a expressão desses marcadores apenas para populações maduras de adipócitos. Além disso, esses marcadores também podem ser expressos por outros tipos celulares e não são específicos para adipócitos. Por exemplo, ASC-1 está presente em astrócitos e neurônios32, CD34 é um marcador de células-tronco hematopoéticas33, CD36 está presente em plaquetas, fagócitos mononucleares, hepatócitos, miócitos e alguns epitélios33, e CD59 é expresso em células endoteliais e linfoides34,35. Portanto, como solução alternativa, o vermelho do Nilo, coloração fluorescente seletiva para lipídios intracelulares, foi utilizado como possível candidato à triagem de adipócitos. Os adipócitos armazenam uma massa significativa de lipídios que podem ser liberados e usados para produzir energia, construir membranas ou como moléculas de sinalização que regulam o metabolismo36. O corante vermelho do Nilo já foi usado em citometria de fluxo e microscopia para corar adipócitos derivados de CTMs murinas e humanas37. Estudos anteriores relataram o uso do vermelho do Nilo para adipócitos derivados da ESC e o aumento dos marcadores de adipócitos após a classificação38. Os adipócitos gerados a partir das CTMs obtidas pelo presente protocolo baseado em AR foram avaliados quanto à sua capacidade de serem corados pelo vermelho do Nilo, indicando sua maturidade, e selecionados para purificá-los. Essas células classificadas em vermelho do Nilo exibiram um aumento de duas a três vezes na expressão dos marcadores de maturação dos adipócitos, incluindo PPARG, C/EBPAe FABP4 em comparação com células não selecionadas, aumentando ainda mais o rendimento de adipócitos derivados de iPSCs. Embora esses marcadores sejam expressos antes do acúmulo lipídico, sua expressão marca uma célula para diferenciação terminal para adipócitos portadores de lipídios. A verificação da eficiência da classificação por esses marcadores nos permite identificar um pool onde todas as células são expressas FABP4, CEBPae PPARg, indicando um pool, que foi pré-destinado à formação de adipócitos maduros. As células são classificadas com base em seu potencial de coloração para vermelho do Nilo. A eficiência de purificação aumentou de duas a três vezes devido ao elevado número de adipócitos na fração não selecionada. O tamanho dos adipócitos portadores de lipídios varia amplamente durante a diferenciação, onde um pool de células com distribuição de tamanho idêntica é classificado. A fração não classificada engloba adipócitos contendo lipídios, mas eles não são totalmente maduros e governados por proporções de tamanho diferentes.
A heterogeneidade das CTMs isoladas do corpo humano já foi relatada39. Essa heterogeneidade depende de vários fatores, como origem das CTM, doadores e condições39. Isso pode levar a variações na sua eficiência no tratamento de diferentes doenças. Este estudo sugere que o tratamento curto da AR de hPSCs produzidas sob condições de cultura compatíveis com boas práticas de fabricação (GMP) daria uma população homogênea de CTMs. Isso indica que o protocolo atual é uma abordagem promissora para gerar um grande número de CTMs de grau clínico que podem ser usadas para terapia baseada em CTM.
A combinação do protocolo de diferenciação de CTM baseado em AR levando à diferenciação de adipócitos e do protocolo de classificação em vermelho do Nilo permitiu obter adipócitos derivados de iPSCs com maior expressão de marcadores funcionais e aumento do rendimento e pureza. Assim, esse protocolo combinado permitiria a geração, em quantidade e pureza suficientes, de adipócitos maduros de indivíduos geneticamente distintos e a descoberta potencial de novas variantes genéticas por trás de distúrbios metabólicos relacionados aos adipócitos.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi foi apoiada pela bolsa GSRA do Qatar National Research Fund (QNRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
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