התמיינות איתנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים לאוכלוסייה טהורה של אדיפוציטים כדי לחקור הפרעות הקשורות לאדיפוציטים
Summary
הפרוטוקול מאפשר יצירת אוכלוסיית אדיפוציט טהורה מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). חומצה רטינואית משמשת להתמיינות iPSCs לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) המשמשים לייצור אדיפוציטים. לאחר מכן, גישת מיון המבוססת על צביעה אדומה של הנילוס משמשת להשגת אדיפוציטים טהורים.
Abstract
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) אפשרה יצירה של סוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים. עם זאת, שיטות ההבחנה הנוכחיות הן בעלות יעילות נמוכה ואינן מייצרות אוכלוסייה הומוגנית של אדיפוציטים. כאן, אנו עוקפים בעיה זו באמצעות שיטה מבוססת all-trans רטינואית לייצור תאי גזע מזנכימליים (MSC) בתפוקה גבוהה. על ידי ויסות מסלולים השולטים בהתפשטות, הישרדות והיצמדות תאים, אסטרטגיית ההתמיינות שלנו מאפשרת יצירה יעילה של גופים עובריים (EBs) המתמיינים לאוכלוסייה טהורה של MSCs רב-עוצמה. המספר הגבוה של MSCs שנוצרו על ידי שיטה זו מספק מקור אידיאלי ליצירת אדיפוציטים. עם זאת, הטרוגניות הדגימה הנובעת מהתמיינות אדיפוציטים נותרה אתגר. לכן, השתמשנו בשיטה מבוססת אדום הנילוס לטיהור אדיפוציטים בוגרים נושאי שומנים באמצעות FACS. אסטרטגיית מיון זו אפשרה לנו לבסס דרך אמינה למדל הפרעות מטבוליות הקשורות לאדיפוציט באמצעות מאגר של אדיפוציטים עם הטרוגניות דגימה מופחתת ופונקציונליות תאים משופרת.
Introduction
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) פועלים כמשאב חולף יעיל לייצור תאים ממוצא מזודרמלי כמו אדיפוציטים, אוסטיאוציטים וכונדרוציטים, אשר יכולים לשמש עוד יותר למידול ההפרעות הגנטיות שלהם. עם זאת, גישות קודמות הסתמכו על השגת MSCs אלה מרקמות בוגרות 1, אשר הטילו את האתגר של השגתם במספרים גבוהים מהתורמים, ואת המגבלה של שמירה על יכולת התפקוד שלהם בתנאי תרבית חוץ גופית תת-אופטימליים 1,2. מכשולים אלה יצרו דרישה גדולה של פרוטוקול ליצירת MSCs במבחנה. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) יכולים לשמש כמקור רב ערך של MSCs, המציגים מאפייני MSC 3,4,5. MSCs הנגזרים מ- iPSCs יכולים לשמש כאופציה טיפולית במספר מחלות. כמו כן, היכולת של MSCs שמקורם ב- iPSCs לייצר אדיפוציטים, הופכת אותם למודל אנושי בעל ערך במבחנה לחקר אדיפוגנזה אנושית, השמנת יתר והפרעות הקשורות לאדיפוציטים.
ניתן לסווג את פרוטוקולי ההתמיינות הנוכחיים של אדיפוציטים לשתי קבוצות, כאשר האחת כוללת התמיינות של אדיפוציטים באמצעות קוקטיילים כימיים או מבוססי חלבון המניבה תשואה של 30%-60%6,7,8,9, ואילו השנייה כוללת מניפולציה גנטית לאינדוקציה חזקה של גורמי שעתוק מרכזיים השולטים בהתפתחות האדיפוציטים כדי לתת תשואה של 80%-90%10, 11. עם זאת, מניפולציה גנטית אינה משחזרת את התהליך הטבעי של התמיינות אדיפוציטים, ולעתים קרובות מסווה את הפרדיגמות העדינות המגיעות במהלך אדיפוגנזה, מה שהופך אותה ללא יעילה למטרות מידול מחלות12,13. לכן, אנו מציגים דרך למיין אדיפוציטים בוגרים שמקורם כימי מאדיפוציטים לא בוגרים על ידי תיוג פלואורסצנטי של אדיפוציטים נושאי שומנים באמצעות אדום הנילוס.
כאן אנו מציגים פרוטוקול הכולל דגירה חולפת של גופים עובריים שמקורם ב- iPSCs (EBs) עם חומצה רטינואית all-trans כדי לייצר מספר גבוה של MSCs המתרבים במהירות, אשר יכולים לשמש עוד יותר לייצור אדיפוציטים14. אנו גם מציגים דרך למיין אדיפוציטים בוגרים שמקורם כימי ממאגר ההתמיינות ההטרוגנית על ידי תיוג פלואורסצנטי של טיפות השומנים שלהם באמצעות צבע ליפופילי; אדום הנילוס. זה יאפשר יצירת אוכלוסייה טהורה של אדיפוציטים בוגרים עם פונקציונליות משופרת כדי למדל במדויק הפרעות מטבוליות הקשורות לאדיפוציטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוא בעל חשיבות עליונה בשל יכולתו לספק MSCs בתפוקה גבוהה וביעילות. ייצור בקנה מידה המוני זה של MSCs התאפשר על ידי דגירה ארעית של EBs הנגזרים מ- iPSCs עם 10 מיקרומטר של RA14,15. טיפול חולף עם 10 מיקרומטר של RA שיפר את תפוקת MSC פי 11.2 עד 1542 פי14,15,<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF) (מענק מס’ NPRP10-1221-160041). מרים אגאדי נתמכה על ידי מלגת GSRA מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF).
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
Referências
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
