Robust differentiering av humana iPSC till en ren population av adipocyter för att studera adipocytassocierade störningar
Summary
Protokollet möjliggör generering av en ren adipocytpopulation från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Retinsyra används för att differentiera iPSC till mesenkymala stamceller (MSC) som används för att producera adipocyter. Därefter används en sorteringsmetod baserad på Nile röd färgning för att erhålla rena adipocyter.
Abstract
De senaste framstegen inom inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har möjliggjort generering av olika celltyper, inklusive adipocyter. De nuvarande differentieringsmetoderna har emellertid låg effektivitet och producerar inte en homogen population av adipocyter. Här kringgår vi detta problem genom att använda en all-trans retinoic-baserad metod för att producera mesenkymala stamceller (MSC) i hög avkastning. Genom att reglera vägar som styr cellproliferation, överlevnad och vidhäftning möjliggör vår differentieringsstrategi effektiv generering av embryonala kroppar (EB) som differentieras till en ren population av multipotenta MSC. Det stora antalet MSC som genereras med denna metod ger en idealisk källa för att generera adipocyter. Provheterogenitet som härrör från adipocytdifferentiering är dock fortfarande en utmaning. Därför använde vi en Nile rödbaserad metod för att rena lipidbärande mogna adipocyter med hjälp av FACS. Denna sorteringsstrategi gjorde det möjligt för oss att etablera ett tillförlitligt sätt att modellera adipocytassocierade metaboliska störningar med hjälp av en pool av adipocyter med minskad provheterogenitet och förbättrad cellfunktionalitet.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) fungerar som en effektiv övergående resurs för att producera celler av mesodermalt ursprung som adipocyter, osteocyter och kondrocyter, som vidare kan användas för att modellera deras respektive genetiska störningar. Tidigare tillvägagångssätt förlitade sig dock på att uppnå dessa MSC från vuxna vävnader 1, vilket innebar utmaningen att erhålla dem i stort antal från givarna och begränsningen att hålla dem funktionellt livskraftiga under suboptimala in vitro-odlingsförhållanden 1,2. Dessa hinder har skapat en stor efterfrågan på att ha ett protokoll för att generera MSC in vitro. Humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) kan användas som en värdefull källa till MSC och uppvisar MSC-egenskaper 3,4,5. iPSCs-härledda MSC kan användas som ett terapeutiskt alternativ vid flera sjukdomar. Dessutom gör förmågan hos iPSC-härledda MSC att generera adipocyter dem till en värdefull in vitro human modell för att studera human adipogenesis, fetma och adipocytassocierade störningar.
Nuvarande differentieringsprotokoll för adipocyter kan klassificeras i två grupper, där den ena involverar differentiering av adipocyter med användning av kemiska eller proteinbaserade cocktails som ger ett resulterande utbyte på 30%-60%6,7,8,9, medan den andra involverar genetisk manipulation för robust induktion av viktiga transkriptionsfaktorer som styr adipocytutveckling för att ge ett utbyte på 80%-90%10, 11. Genetisk manipulation rekapitulerar emellertid inte den naturliga processen för adipocytdifferentiering och maskerar ofta de subtila paradigmerna som anländer under adipogenesis, vilket gör den ineffektiv för sjukdomsmodelleringsändamål12,13. Därför presenterar vi ett sätt att sortera kemiskt härledda mogna adipocyter från omogna genom att fluorescerande märka lipidbärande adipocyter med Nile röd.
Här presenterar vi ett protokoll som involverar övergående inkubation av iPSCs-härledda embryoidkroppar (EB) med all-trans retinsyra för att producera ett stort antal snabbt prolifererande MSC, som kan användas vidare för att generera adipocyter14. Vi presenterar också ett sätt att sortera kemiskt härledda mogna adipocyter från den heterogena differentieringspoolen genom att fluorescerande märka sina lipiddroppar med hjälp av ett lipofilt färgämne; Nilen röd. Detta skulle möjliggöra generering av en ren population av mogna adipocyter med förbättrad funktionalitet för att exakt modellera adipocytassocierade metaboliska störningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är av största vikt på grund av dess förmåga att tillhandahålla MSC i hög avkastning och effektivitet. Denna storskaliga produktion av MSC möjliggjordes genom övergående inkubation av iPSCs-härledda EB med 10 μM RA14,15. Övergående behandling med 10 μM RA ökade MSC-utbytet med 11,2 till 1542 gånger14,15, med detta protokoll tillämpligt på både iPSC och hPSC. Vid denna do…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av ett bidrag från Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi stöddes av GSRA-stipendium från Qatar National Research Fund (QNRF).
Materials
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
| bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
| Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
| Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
| PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
| Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
| Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
| Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |
Referências
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
- Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
- Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
- Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
- Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
- Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
- van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
- Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
- Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
- Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
- Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
- Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
- Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
- Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
- di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
- De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
- Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
- Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
- Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
- Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
- Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
- Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
- Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
- Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
- Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
- Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
- Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
- Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
- Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
- Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
- Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells–a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
- Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).
