Protokollen tillater generering av en ren adipocytpopulasjon fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Retinsyre brukes til å differensiere iPSCs til mesenkymale stamceller (MSC) som brukes til å produsere adipocytter. Deretter brukes en sorteringsmetode basert på Nilrødfarging for å oppnå rene adipocytter.
Nylige fremskritt innen indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har gjort det mulig å generere forskjellige celletyper, inkludert adipocytter. Imidlertid har de nåværende differensieringsmetodene lav effektivitet og produserer ikke en homogen populasjon av adipocytter. Her omgår vi dette problemet ved å bruke en all-trans retinoic-basert metode for å produsere mesenkymale stamceller (MSC) i høyt utbytte. Ved å regulere veier som styrer celleproliferasjon, overlevelse og adhesjon, tillater vår differensieringsstrategi effektiv generering av embryonale legemer (EB) som skiller seg ut til en ren populasjon av multipotente MSC-er. Det høye antallet MSC generert av denne metoden gir en ideell kilde for å generere adipocytter. Imidlertid er prøveheterogenitet som følge av adipocytdifferensiering fortsatt en utfordring. Derfor brukte vi en Nilrødbasert metode for rensing av lipidbærende modne adipocytter ved bruk av FACS. Denne sorteringsstrategien tillot oss å etablere en pålitelig måte å modellere adipocytassosierte metabolske forstyrrelser ved å bruke en pool av adipocytter med redusert prøveheterogenitet og forbedret cellefunksjonalitet.
Mesenkymale stamceller (MSC) fungerer som en effektiv forbigående ressurs for å produsere celler av mesodermal opprinnelse som adipocytter, osteocytter og kondrocytter, som videre kan brukes til å modellere deres respektive genetiske lidelser. Tidligere tilnærminger baserte seg imidlertid på å oppnå disse MSC-ene fra voksent vev 1, noe som medførte utfordringen med å skaffe dem i høyt antall fra donorene, og begrensningen av å holde dem funksjonelt levedyktige under suboptimale in vitro-kulturforhold 1,2. Disse hindringene har gitt stor etterspørsel etter å ha en protokoll for generering av MSC-er in vitro. Humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs) kan brukes som en verdifull kilde til MSC, med MSC-egenskaper 3,4,5. iPSCs-avledede MSCer kan brukes som et terapeutisk alternativ i flere sykdommer. Også evnen til iPSCs-avledede MSCer til å generere adipocytter, gjør dem til en verdifull in vitro menneskelig modell for å studere human adipogenese, fedme og adipocytt-assosierte lidelser.
Nåværende differensieringsprotokoller av adipocytter kan klassifiseres i to grupper, med en som involverer differensiering av adipocytter ved bruk av kjemiske eller proteinbaserte cocktailer som gir et resulterende utbytte på 30% -60% 6,7,8,9, mens den andre involverer genetisk manipulasjon for robust induksjon av viktige transkripsjonsfaktorer som styrer adipocytterutvikling for å gi et utbytte på 80% -90%10, 11. Genetisk manipulasjon rekapitulerer imidlertid ikke den naturlige prosessen med adipocytdifferensiering, og maskerer ofte de subtile paradigmene som kommer under adipogenese, noe som gjør den ineffektiv for sykdomsmodelleringsformål12,13. Derfor presenterer vi en måte å sortere kjemisk avledede modne adipocytter fra umodne ved fluorescerende merking av lipidbærende adipocytter ved bruk av Nilrød.
Her presenterer vi en protokoll som involverer forbigående inkubasjon av iPSCs-avledede embryoidlegemer (EB) med all-trans retinsyre for å produsere et høyt antall raskt prolifererende MSC, som videre kan brukes til å generere adipocytter14. Vi presenterer også en måte å sortere kjemisk avledede modne adipocytter fra det heterogene differensieringsbassenget ved fluorescerende merking av lipiddråpene ved hjelp av et lipofilt fargestoff; Nilen rød. Dette vil tillate generering av en ren populasjon av modne adipocytter med forbedret funksjonalitet for nøyaktig modellering av adipocytassosierte metabolske forstyrrelser.
Denne protokollen er svært viktig på grunn av dens evne til å levere MSC-er i høy ytelse og effektivitet. Denne masseskalaproduksjonen av MSC-er ble gjort mulig ved forbigående inkubasjon av iPSCs-avledede EB-er med 10 μM RA14,15. Forbigående behandling med 10 μM RA forbedret MSC-utbyttet med 11,2 til 1542 fold14,15, med denne protokollen som gjelder på både iPSCs og hPSCs. Ved denne dosen og be…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av et tilskudd fra Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi ble støttet av GSRA-stipend fra Qatar National Research Fund (QNRF).
Adiponectin | Abcam | ab22554 | Adipocyte maturation marker |
anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | MSC differentiation marker |
anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC differentiation marker |
anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC differentiation marker |
anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | MSC differentiation marker |
anti-CD44 | abcam | ab93758 | MSC differentiation marker |
anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 |
MSC differentiation marker |
anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC differentiation marker |
anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC differentiation marker |
bFGF | R&D | 233-FP | MSC culture media supplement |
C/EBPA | Abcam | ab40761 | Adipocyte maturation marker |
Dexamethasone | Torics | 1126 | Adipocyte differentiation media supplement |
FABP4 | Abcam | ab93945 | Adipocyte maturation marker |
Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10082147 | MSC culture media supplement |
Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC culture media supplement |
IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Adipocyte differentiation media supplement |
Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Adipocyte differentiation media supplement |
Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | Adipocyte differentiation media supplement |
Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Basal media for preparing matrigel |
Low glucose DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC culturing media |
Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte differentiation media |
Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Sorting marker for adipocyte |
Penicillin | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte media supplement |
Phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190144 | wash buffer |
Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | wash buffer |
PPARG | Cell Signaling Technology | 2443 | Adipocyte maturation marker |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Dissociation reagent |
Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625 | MSC differentiation media supplement |
Rock inhibitor | Tocris | 1254/10 | hPSC culture media supplement |
Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Adipocyte differentiation media supplement |
StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC culture media |
Triton | Thermo Fisher | 28314 | Permebealization reagent |
Trypsin | ThermoFisher | 25200072 | Dissociation reagent |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Wash buffer |